免疫荧光利用带有荧光染料的抗体的特异性来识别其抗原，因此可以通过荧光染料在荧光显微镜下观察目标分子的分布。免疫荧光被广泛用作免疫染色的一个例子，并且是免疫组织化学的一个具体例子，它利用荧光团来可视化特殊生物分子的位置。有两类免疫荧光技术，包括直接和间接。

　　以下是组织和单层细胞中间接免疫荧光的协议。

　　免疫荧光协议

　　材料

　　10 PBS (pH 8.0)。

　　甲醛：16%，不含甲醇，新鲜使用，开瓶后在 4°C 避光保存，在 PBS 中稀释备用。

　　封闭缓冲液：（1? PBS，含 5% 正常山羊血清和 0.3% Triton X-100）：加入 2.5 ml 10X PBS，1.25 ml 来自与二抗相同物种的正常血清（例如，正常山羊血清、正常驴血清) 和 21.25 ml ddH2O 并充分混合。在搅拌的同时，加入 75 µl Triton X-100。

　　抗体稀释缓冲液（1? PBS 含 1% BSA 和 0.3% Triton X-100）：加入 4 ml 10? PBS 和 120 µl Triton X-100 加到 0.4 g BSA。用 ddH2O 使最终体积达到 40 ml，并充分混合。

　　一抗和二抗。

　　延长抗褪色试剂。

　　组织或细胞样本

　　组织免疫荧光方案

　　对于器官组织的免疫荧光标记，使用多聚甲醛固定和石蜡包埋方案。器官是通过解剖获得的。

　　然后，通过轻轻去除所有 PBS 以及孵育室，使解剖的器官完全粘附在载玻片表面。

　　在器官脱水前，将载玻片快速浸入冷 (-20°C) 丙酮中 5 分钟。

　　将含有 1% Triton X-100 的 PBS 添加到载玻片中，并在组织周围使用 PAP 笔环以尽量减少试剂量。

　　载玻片在由培养皿和 PBS 湿纸制成的加湿室中于 4°C 下孵育过夜。

　　第二天早上，载玻片在 PBS 中洗涤 3 次并用于免疫定位。

　　载玻片在封闭缓冲液（PBS、0.1% Triton X-100、10% 正常山羊血清）中孵育 30 分钟，然后与针对靶蛋白的一抗孵育 2.5 小时。按照制造商的建议将一抗应用于稀释的载玻片。

　　然后将载玻片在 PBS 中洗涤 3 次，并与二抗一起孵育。根据所用一抗的类型，二抗用不同的荧光基团进行标记。也按照制造商的建议应用二抗。

　　载玻片在 PBS 中洗涤 3 次，在水中漂洗并用含有 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 的 ProLong® 金抗褪色封固剂封固以对细胞核进行复染。

　　然后在荧光显微镜下观察载玻片。

　　单层细胞的免疫荧光方案

　　在免疫荧光程序之前，在盖玻片上培养和制备单层细胞。

　　将细胞用 PBS 洗涤两次，并在室温下用 3% 多聚甲醛固定 12 分钟。

　　然后通过在 PBS 中用 100 mM 洗涤盖玻片两次来淬灭多聚甲醛。用 PBS 再次洗涤后，用 PBS 中的 2% 血清封闭盖玻片 1 小时。

　　用 PBS 清洗盖玻片两次。

　　按照制造商的建议在室温下用初级抗体孵育盖玻片。

　　然后用 PBS 洗涤四次，并与结合适当荧光基团的二抗孵育。按照制造商的建议使用二抗。

　　用 PBS 清洗盖玻片 3 次。

　　使用 ProLong Antifade 将盖玻片安装到载玻片上。用荧光显微镜观察荧光。