反转录实验过程看似简单的反转录实验，但也受到多种因素的影响，如模板、引物、酶以及反应条件等。

　　模 板

　　RNA自身结构、纯度和浓度的测定、完整度、gDNA的去除

　　① RNA自身结构（高GC、复杂二级结构）

　　RNA由于自身序列折叠，具有不同复杂的二级结构：配对的双链RNA呈螺旋，发卡环，突环，内环，多分支环等结构。由于配对碱基不同，其配对的稳性也不同，如G与C之间的配对，三对氢键，最为稳定。A与U为两对氢键相互作用；G与U为一对氢键相互作用，最不稳定。故对于RNA模板来讲，GC含量越高，二级结构越为复杂。

　　在进行反转录的过程中，当引物延伸到有二级结构的地方，反应就会被迫终止，影响cDNA的合成长度。此时可建议先将模板进行65℃孵育5 min然后迅速冰上冷却使二级结构变性；同时可通过在较高的温度下（如55℃）反应以降低RNA二级结构的形成。

　　②纯度和浓度的测定

　　RNA纯度会很大程度地影响反转录实验，如RNA纯化过程中混入的盐、金属离子、乙醇、苯酚等均是常见的逆转录酶抑制剂。对于RNA纯度的测定，通常会选用Nano drop进行测定。纯度完好的RNA：1.8＜OD260/OD280＜2.0（＜1.8时表明有蛋白质或酚污染，可增加酚抽提；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）；OD260/OD230应大于2。（＜2表明有异硫氰酸胍，β-巯基乙醇或乙醇的残留；可进行再次沉淀，重复乙醇洗涤）。

　　③完整度

　　RNA的完整度在很大程度上影响着cDNA合成的长度与质量。在进行RNA提取处理储存和实验过程中需要采取特殊的保护措施，如操作者佩戴手套和口罩，全程使用无RNA酶污染的实验耗材等。对于下游的克隆实验，RNA完整度将会影响cDNA的合成长度，从而影响目的基因的合成。对于下游的目的基因定量实验，将会严重影响其CT值，从而影响定量结果精准度。

　　④gDNA的去除

　　在进行下游qPCR实验过程中Totol RNA中混入的gDNA可直接作为PCR反应的模板进行扩增，造成实验结果的假阳性。因此在反转录之前必须要对RNA模板进行去gDNA处理，保证模板中仅有cDNA。可通过加入DNaseⅠ去除gDNA。但是在反转录实验前需将DNaseⅠ灭活（通过高温加热或加入EDTA），否则该酶会将cDNA降解，但是高温灭活DNaseⅠ会造成RNA的降解和损失，加入EDTA灭活又会引入新的RNA酶抑制剂。

　　引 物

　　Oligo(dT)、Random N6-N9、基因特异性引物

　　① Oligo(dT)

　　Oligo(dT)引物是约12-18个多聚胸腺嘧啶T组成的重复寡核苷酸序列，能够特异性地与真核生物mRNA的ploy(A)尾退火，故不适合缺少ploy(A)尾结构的RNA，如原核生物RNA或microRNA，也不适用于已降解的RNA，如FFPE样品中RNA。

　　真核生物中mRNA仅占总RNA的1%-5%左右，通常在进行从真核生物中构建cDNA文库，或者克隆全长cDNA以及3’RACE等研究时会优先选择 Oligo(dT)引物。

　　对于复杂模板RNA，如含较多二级结构，在进行cDNA的合成延伸过程中，当延伸到二级结构处时，可能会造成延伸终止，若选择Oligo(dT)可能会造成mRNA 5’端信息的丢失。

　　②Random N6-N9

　　随机引物是由随机碱基组成的寡核苷酸，通常由6个核苷酸组成，称为随机6聚体。该种引物不具备特异性，rRNA, tRNA,非编码RNA，小RNA，降解RNA，复杂二级结构的RNA等都可以作为其模板。该类引物可提高cDNA的产量和浓度，但是会使合成的cDNA长度变短。

　　③基因特异性引物

　　基因特异性引物能够与模板特异性互补，产生目标性很强的cDNA，对于后续的PCR扩增更特异，适用于已知目的序列。通常应用于一步RT-PCR反应。当使用基因特异性引物（GSP）无法有效合成第一链cDNA时，可选用Oligo(dT)或随机引物。

　　酶

　　不同的逆转录酶具有不同的功能活性，表现出不同的逆转录效率，如合成cDNA的长度，产量，对复杂模板的适应程度等。

　　1）RNA指导的DNA聚合酶活性：以RNA为模板，催化dNTP聚合形成DNA的过程。

　　2）RNaseH活性：在反应过程中切割RNA：cDNA杂合链中的RNA模板。降低此活性，可避免在合成较长cDNA之前模板RNA被降解掉。

　　3）DNA指导的DNA聚合酶活性：以反转录合成的第一条cDNA单链为模板，再合成第二条cDNA分子。

　　4）热稳定性：此性能是影响cDNA合成的重要因素。升高反转录过程中的温度，有助于高GC或复杂二级结构RNA模板的变性，实现全长cDNA的合成。

　　5）保真性：RNA反转录为cDNA过程中的序列精确度。由于逆转录酶不具备3’-5’外切酶活性，因此没有校正功能，所以合成的cDNA出错率较高。通常，除测序对精准度要求较高外，其他情况下，反转录中引入的错误数量可忽略不计，因为cDNA中的错误不会被放大。

　　6）抗抑制能力：当模板纯度较低、抑制物较多时，抗抑制能力强的逆转录酶才能正常进行cDNA的合成。

　　反应过程

　　反转录温度通常推荐使用42℃，对于高GC含量模板或者复杂模板，可将反转录温度提高到50℃。反转录产物可立即用于qPCR反应，也可-20℃短期保存；若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

　　总之，高效率的逆转录反应建立在高质量的RNA模板、逆转录酶，合适的引物，适宜的反应条件等基础上的。实验过程中要注意到所有的影响因素，才能合成出适用于下游实验的高质量cDNA。