毫无疑问，您听说过流式细胞术，这是在单细胞水平上分析异质细胞群的首选方法。但是，嘿！你想知道一种很酷的方法来检测和区分病毒颗粒吗？你听说过流动病毒测定法吗？

　　如果你还没有，那么你来对地方了！我们将带您了解这项技术是什么，它的应用和与您的生物学研究的相关性，以及您如何在实验中开始使用它。

　　当前的病毒检测方法：陷阱和问题

　　检测病毒颗粒的常用测定法包括噬斑测定法和酶联免疫吸附测定法（ELISA）。当我们需要分析病毒蛋白的表达时，通常会使用蛋白质印迹，但它们可能很麻烦。

　　虽然斑块测定和 ELISA 是金标准并且效果很好，但在多路复用实验方面它们就没有那么灵活了。例如，一次将捕获的抗体（仅一种）包被在一个 ELISA 板上。至于蛋白质印迹，可以检测多种蛋白质，但这涉及剥离原始抗体并重新探测不同的蛋白质。

　　显然是时候采用一种新方法来快速量化和实时分析原生形式的病毒颗粒了。

　　Flow Virometry：它能为您做什么？

　　基本上，流式病毒测定法是一种使用流式细胞仪表征和分析单个病毒颗粒的专门方法。

　　流式细胞仪可以提取悬浮在液体中的样本并对每个单独的颗粒（包括细胞和病毒）进行计数。但它可以做很多很酷的事情，数不胜数。

　　例如，它可以分辨病毒颗粒表面表达的病毒蛋白的大小和水平的差异。

　　平均病毒颗粒大小超小！它的范围从 17 纳米到 350 纳米，[1] 比尘埃颗粒小一千倍。

　　因此，您需要微调您的流式细胞仪并仔细准备样品以获得最佳结果。查看我们关于流式细胞仪如何工作的相关文章以获得更深入的解释，或者继续阅读（图 1）。

　　流式细胞仪的工作原理

　　A. 流体系统

　　您的样品通过一系列管子被流体系统吸收，直到它到达一个狭窄的通道，每个单独的粒子都可以在这里聚焦。

　　B. 光学和探测器系统

　　这包括不同的激光器、滤光片和检测器。滤光片对通过的荧光信号的波长具有选择性。然后通过检测器将荧光信号转换为电信号。

　　C. 数据采集系统

　　最后一部分存储每个粒子的所有数字信号以供进一步分析。

　　如何开始？

　　了解您的细胞仪

　　并非所有的细胞仪都是一样的。一些微型细胞仪适用于计数红细胞，有些还配备了细胞分选能力。这种昂贵的设备需要极高的操作精度。因此，请咨询您的流动设施经理，了解如何设置机器。

　　您需要弄清楚的第一件事是您将使用哪种类型的流式细胞仪。大多数流式细胞仪都经过校准以检测细胞（直径范围从 10 mM 到 100 mM）。我将简要介绍如何调整您的典型流式细胞仪以检测病毒颗粒。

　　第一次修改：前向散射设置（FSC）

　　当光束以 90 度角撞击病毒颗粒时，穿过颗粒的光被折射，可以记录 FSC 角度。典型的 FSC 通常设置在 0.5-15 度的角度。

　　对于以更宽散射角散射光的微观粒子，下一代细胞仪需要将检测角度设置为 15-70 度（缩小的广角检测）。

　　第二个修改：增加激光和探测器功率

　　光源（激光）的功率也需要提高一两个档次。这是因为病毒粒子的平均尺寸小于光源的波长，因此它对光源的折射很差。[1]

　　此外，流式细胞仪应配备高性能光电倍增管（PMT）而不是传统的光电二极管检测器[1]，这显着提高了检测灵敏度。

　　Tang等人描述的方法。可以为学习如何优化激光电压提供一个很好的起点。[2]

　　第三修改：过滤！过滤！过滤！

　　缓冲液的过滤对于最大限度地减少样品中的背景噪音至关重要。为了尽量减少缓冲系统中由晶体或微小气泡等杂质产生的背景噪音，用于流动病毒测定的缓冲系统应使用 0.1 mM 过滤器进行预过滤。

　　话虽如此，所有病毒样本储备都应使用 0.45 mM 过滤器进行预过滤，以防止包含细胞碎片和蛋白质聚集体。

　　最后的考虑

　　已显示降低流速通常会增加检测的信噪比。

　　病毒颗粒的标记

　　要真正识别您想要研究的病毒，您可能需要考虑能够识别您感兴趣的病毒的抗体，以将病毒颗粒与任何背景噪音（即细胞、碎片、外泌体）区分开来。

　　强烈建议使用不同种类的探针对病毒群进行荧光标记。下面我将介绍一些常用的荧光标记病毒群的方法。

　　用于表面标记的病毒特异性单克隆抗体

　　一种直接的方法是获得一种单克隆抗体，该抗体可特异性识别您有兴趣研究的病毒表面蛋白。想象一下这些抗体是特定病毒表面抗原的标签。

　　病毒抗原要丰富，单克隆抗体可以直接标记，也可以通过二抗用荧光分子标记。

　　预先与纳米珠结合的病毒特异性抗体可以改善光散射

　　一种方法是首先使用纳米粒子偶联抗体来捕获病毒，然后进行病毒特异性荧光染色。[3]

　　这种方法的一大优点是您可以通过使用磁性纳米珠和病毒特异性抗体来丰富病毒种群。然而，使用纳米珠时需要注意的一个问题是，多个病毒可能会附着在一个珠子上，从而无法进行单粒子分析。

　　病毒核酸的标记

　　这种方法可能对 DNA 病毒更好，因为它们具有更大的基因组。大量的 DNA 病毒样本可以用 SYBR Green 等常见的 DNA 染料固定和染色。[4] 由于低拷贝数和小基因组大小，RNA 病毒可能对核酸染色更具挑战性。[4]

　　包膜病毒的亲脂性染料

　　对于包膜病毒，您可以尝试用亲脂性染料染色它们的脂质双层膜。实验已成功地将 DiD、DiO 和 Dil 染料用于 HIV、牛痘和登革热。[4] 然而，来自外泌体和微囊泡的污染始终是一个问题。

　　GFP病毒

　　如果您拥有表达绿色荧光蛋白 (GFP) 等荧光分子的基因工程病毒，它肯定会让您的生活更容易被追踪。此外，如果商业上没有荧光珠，当您尝试校准机器以进行流式病毒测定时，不同大小的 GFP 病毒可能会派上用场。

　　以这种方式标记病毒的一个主要警告是，使用抗体或染料进行操作可能会影响病毒正确感染或复制的能力，因此如果您计划进行下游实验，请仔细考虑这一举措。

　　实验对照

　　对照实验对于您完成分析至关重要。以下是使用流式病毒测定法分析您感兴趣的病毒的一些建议。

　　流式细胞仪需要重新校准以分析病毒颗粒。为确保正确完成此操作，您可以使用市售的各种尺寸的合成微珠，以确保您的机器能够区分微观分子。

　　应进行病毒滴定以确保 FSC 和荧光检测的最佳范围。

　　传统的病毒生物测定，如噬斑测定、ELISA 或 RT-PCR 可以并行运行，以与流动病毒测定的结果进行比较。

　　应用

　　那么，如果我们可以使用流式病毒测定法成功追踪我们的病毒，那么这项技术的应用是什么？让我们仔细看看一些应用程序。

　　检测单个病毒颗粒以研究离散病毒颗粒和病毒表面

　　您想检测生活在附近湖泊中的所有外来微生物吗？流动病毒测定法不仅对生态学研究非常有用，而且对有害病原体的公共卫生筛查也很有用。例如，我们可能需要准备一种快速简便的方法来筛查可能导致疾病爆发的任何潜在病原体。

　　流式病毒测定法也可以为临床环境中的快速病毒检测开辟新途径。流动病毒测定的高通量特性意味着我们可以快速筛查不同患者样本中的潜在病毒。

　　已经有人提议使用流式病毒测定法快速筛查 SARS-CoV-2。[5] 这种快速筛选方法可以与广泛使用的高灵敏度 RT-PCR 方法一起使用，以取得很好的效果。

　　流式病毒测定可以让您在实验室环境中跨批次快速检测和表征相同的病毒。例如，您可以研究不同水平的病毒表面抗原表达如何与病毒的传染性水平相关。[6]

　　病毒种群或亚型之间的病毒分类和辨别

　　使用合适的流式细胞仪，您还可以对单个批次中的不同病毒群进行分类。我们都知道，即使是在一个批次中，每个病毒颗粒的表面蛋白补体和遗传含量都是不同的。

　　例如，您可以通过将病毒表面蛋白数量和基因组结构的这些变异分类到不同的群体中来研究这些变异如何在传染性和生命周期中发挥重要作用。

　　此外，为了提高病毒原液的纯度，可以使用病毒特异性磁珠进行预分选。一项 HIV 研究利用这种方法使用常规流式细胞仪纯化和区分 HIV 颗粒（CD45 -从 CD45 + ）外泌体群体。[7]

　　病毒定量

　　任何病毒的定量在实验室和临床环境中都很重要。传统上，基于细胞的测定（例如噬斑测定）用于估计每毫升感染性病毒颗粒的数量。根据病毒的类型，在细胞单层上形成斑块需要不同的孵育时间。

　　其他方法，如 ELISA 或 RT-PCR，可能需要长达一天的时间才能完成。因此，我们需要一种用于病毒颗粒检测和定量的高通量检测。好吧，进入流动病毒测定法！科学家们已经使用这种技术成功地量化了海洋和呼吸道病毒。[8,9]

　　但是，此应用程序的一个警告是，流式病毒测定法可能无法区分感染性病毒和非感染性病毒。

　　疫苗质量保证

　　对于那些正在筛选病毒抑制化合物的人，你有没有想过为什么病毒抑制化合物的活性会根据你使用的特定批次的病毒而变化？流式病毒测定法可能能够帮助您解决病毒批次之间的质量和数量差异。

　　对于制药公司而言，确保不同批次疫苗的质量保持一致至关重要。Flow virometry 是一种潜在的高通量解决方案，用于监测病毒库的质量。[10]

　　下一步是什么？

　　流式病毒测定法是一种用于快速检测和表征病毒的令人兴奋的工具。在临床环境中，它具有提供快速和高通量病毒颗粒检测的巨大潜力。在实验室中，它可用于生物研究中病毒的定量和表征。其高通量能力是针对不同病毒库的出色筛选和质量控制工具。此外，不同的病毒种群也可以根据其独特的特征进行分类。这确实是研究病毒的激动人心的时刻。

　　Flow Virometry 的注意事项和注意事项

　　虽然流动病毒测定作为一种技术具有巨大的潜力，但仍需要解决一些警告。

　　首先，我们通常以纳米级观察单个病毒颗粒这一事实需要对流式细胞仪进行非常精细的调整和严格的背景控制。例如，需要使用 0.1 mM 过滤器冲洗和过滤流体系统，以确保最低程度的微粒污染。[1]

　　除此之外，所有病毒样本都需要用 0.45 mM 过滤器过滤，以去除细胞碎片和其他污染物。

　　其次，除了病毒颗粒外，病毒原液中还经常存在微泡。由于它们的大小大致相似，您如何区分它们？在这里，囊泡上特定标记的荧光染色成为一个关键问题。

　　最后，我们如何设计配备更好的流体、更强大的激光器和改进的检测器的下一代流式细胞仪，以引领我们进入纳米粒子流式细胞仪时代？

　　科学家们已经在考虑使用大规模细胞仪来研究病毒。[1] 还开发了一种新的基于半导体的流式细胞仪，带有超灵敏的检测器。[11]

　　随着传染病的不断出现，迫切需要开发一种高通量的方法来检测和表征每种传染病。Flow virometry 非常适合我们未来的研究需求。我迫不及待地想知道使用流式病毒测定法对病毒的未来发现！