酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）作为目前应用最广泛的免疫学检测技术，相较于其他技术，在灵敏度方面有着巨大优势。

　　它将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，灵敏度可达每毫升纳克(ng/mL)水平甚至皮克(pg/mL)水平！同时也赋予了该技术高通量筛选的可能！

　　目前常用的ELISA方法有直接法、间接法、双抗夹心法和竞争法，其中，测定蛋白等大分子时双抗夹心ELISA法是最为常用的一种。

　　今天小P就和大家分享一下双抗夹心ELISA实验的操作方法和疑难解析，希望对你们有帮助！

　　01

　　双抗夹心ELISA实验原理

　　双抗夹心法ELISA是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体（捕获抗体），然后和待检样本中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体（检测抗体），与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体—抗原—固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。整个过程中，待检抗原经过捕获抗体和检测抗体双重筛选，具有高特异性。

（双抗夹心ELISA原理）

　　02

　　双抗夹心ELISA样本制备

　　A.血清

　　全血标本自然凝集30min后1000×g离心15min，取澄清，即可检测。澄清可存放于-20℃，避免反复冻融。

　　B.血浆

　　可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30min内于2-8℃、1000×g离心15min，或将标本放于-20℃，避免反复冻融。（注意：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测）

　　C.细胞上清

　　收集细胞培养液，离心取上清，-20℃存放，避免反复冻融。

　　D.细胞裂解样本

　　1.收集细胞后，用预冷的10mM PBS洗3次，5000×g离心5min。

　　2.细胞计数，离心弃上清；

　　3.加PMSF至细胞裂解液中，终浓度为1mM；

　　4.按每1×107个细胞，加入1ml细胞裂解液（含PMSF），冰上裂解 30min，其间上下颠倒使裂解更充分，超声波破碎处理；

　　5.4℃，10000×g离心10min；

　　6.检测细胞裂解样本总蛋白浓度；

　　7.整个过程需在冰上操作，防止蛋白降解。

　　E.组织裂解样本

　　1.加PMSF至细胞裂解液中，终浓度为1mM；

　　2.预先将待检组织用剪刀剪碎，液氮研磨，再按每100mg组织加1 mL裂解液，用研磨器进行研磨，得到的匀浆液可利用超声破碎处理；

　　3.4℃，10000×g离心10min，取上清，-80℃存放；

　　4.检测组织裂解样本总蛋白浓度；

　　5.整个过程需在冰上操作，防止蛋白降解。

　　F.尿液

　　收集尿液后，1000×g离心20min，取上清，-20℃或者-80℃存放，避免反复冻融。

　　G.人乳

　　收集样本后，10000×g离心15min，取澄清部分，浑浊液再次离心，取澄清，收集澄清部分，-20℃存放，避免反复冻融。

　　03

　　双抗夹心ELISA操作步骤

　　ELISA实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）。试剂或样品稀释时，确保混匀，同时尽量避免起泡。

　　1.包被抗体：用碳酸盐缓冲液（CBS）或者磷酸盐缓冲液（PBS）根据实验需要，将包被抗体稀释到一定的稀释度，100μl/孔包被， 37℃、2h或者4℃过夜。

　　2.洗板：弃孔内液体，甩干，10mM PBST(10mM PBS + 0.05% Tween-20)洗板2次，每次浸泡1-2min， 350μl/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。

　　3.封闭：含1% BSA或者5%脱脂牛奶的10mM PBST(10mM PBS + 0.05% Tween-20)做封闭液，350-400μl/孔，37℃、2h。

　　4.洗板：同步骤2。（备注：商品化试剂盒一般已经预包被了包被抗体在酶标板上，不需要进行1-4步骤，使用前请注意核实）。

　　5.加样：分别设零孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl。（注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，一块板要在10 min内上完样品。）酶标板加上盖或覆膜，37℃反应60-120min。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

　　6.洗板：弃孔内液体，甩干，10mM PBST（10mM PBS + 0.05% Tween-20）洗板4次，每次浸泡1-2min，350-400μl/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。

　　7.加检测抗体：根据实验需要，将检测抗体用PBST稀释到一定的稀释度，100μl/孔，37℃、1h。

　　8.洗板：同步骤6。

　　9.加二抗：根据实验需要，将二抗用10mM PBST稀释到一定的稀释度，100μl/孔，37℃、1h。

　　10.洗板：同步骤6。

　　11.酶标仪读值：以630nm为校正波长，用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），在加终止液后5min内进行读数。

　　12.结果判断：

　　a.每个标准品和样本的OD值须减去零孔的OD值，如设置复孔，则应取其平均值；

　　b.以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，使用专业制作曲线软件进行四参数拟合（4-PL），如Origin、ELISACalc等，根据样品的OD值由标准曲线推算出相应的拟合浓度，再乘以稀释倍数即为样本的测定浓度。