1. 方案设计问题

　　1.1 密码子移位：翻译起始mRNA与插入片段序列形成二级结构，外源基因序列内部有核糖体结合位点、SD序列或者其他干扰性元件。

　　1.2 稀有密码子问题：可以使用相关软件分析稀有密码子问题，建议有条件的实验室进行重组蛋白表达前密码子分析优化；起始位点前15个氨基酸的密码子对表达至关重要；连续2个稀有密码子可能导致表达效率大大降低。

　　1.3 真核蛋白信号肽问题：大肠杆菌缺乏加工真核蛋白信号肽的机制。

　　1.4 GC含量太高：一般GC含量超过70%都是难于表达，通过基因优化降低GC含量。

　　1.5 蛋白大小问题：一般小于10kD或者大于100kD蛋白都是难于表达。

　　1.6 标签蛋白的选择：

　　在尽可能不影响目标蛋白结构的情况下，选择合适的标签，通过标签蛋白的高产量强启动表达带动目标蛋白的表达。

　　2. 操作过程问题

　　质粒构建，表达工程菌使用等失误造成。

　　2.1 质粒构建完之后，除了普通的酶切鉴定和PCR鉴定外，必须测序确认，无任何突变，更不能多余或者缺失碱基，确认外源片段插入后读码框与载体步调完全一致。

　　2.2 表达宿主菌首先必须确认标准有效，必须与载体质粒配套，比如，我们配合pET系列载体T7启动子的表达菌是BL21(DE3)，而不是BL21，同时必须清楚知道整个体系的操作，比如，Rosetta(DE3)菌使用时必须额外添加氯霉素，否则，其额外携带的助表达质粒容易丢失；比如，含CspA启动子的载体，诱导剂不是IPTG，而是降低温度。不是所有的表达诱导都是用IPTG来完成的。

　　3. 蛋白容易降解问题

　　宿主菌体内的很多的蛋白酶将重组蛋白降解了，特别是N-端是Arg、 Leu、Lys、Phe、Trp,或Tyr时，这就是N-末端规则；C-末端5个氨基酸是非极性氨基酸也容易被降解。这些蛋白即使表达，如果快速降解了，也很难检测到目的蛋白。

　　4. 培养基问题

　　很多在LB培养基中不表达的重组蛋白，更换了TB或2×YT培养基后表达成功。

　　5. 重组蛋白有毒性或者影响宿主菌生理功能

　　对于这类蛋白应考虑更为严谨的表达载体系统。

　　6. 蛋白痕量或者表达带与宿主菌自身蛋白某高浓度带重叠

　　建议用标签抗体的Western Blot进行确认。

　　7. 分子量异常问题

　　有些蛋白的分子量与预期有偏差，SDS-PAGE电泳是结合电荷/电场与聚丙烯酰胺凝胶孔径分析蛋白质分子量，如果蛋白质本身氨基酸组成不符合均态分布规律，会造成在SDS-PAGE胶中迁移异常，比如P53蛋白，实际分子量只有40多kD,其电泳显示为53kD,后经过分析，其序列内部含有大量的Pro，更多的实例也表明内部富含pro的蛋白序列会造成蛋白在SDS-PAGE电泳中迁移率显示偏大。实验时需要仔细比对诱导/非诱导菌体蛋白带谱差异，结合Western Blot和纯化数据做出判断，必要时可进行质谱确认。