RNA测序分析：您需要知道的一切

2022-05-22 10:36:47

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　　存在三种不同类型的 RNA 分子：信使 RNA (mRNA)、转移 RNA (tRNA) 和核糖体 RNA (rRNA)。结合起来，它们的作用是将 DNA 链的副本从细胞核带到核糖体以产生蛋白质。这种运动部件的复杂混合物在细胞的凝胶状液体中共同作用，产生了我们所知道的生命……

　　难怪它值得排序和分析。

　　DNA vs RNA vs 蛋白质 | 快速入门

　　为了让每个人都在同一页面上，这里有一个快速入门，每个人都可以享受解码的乐趣。这三种化合物——DNA、RNA 和蛋白质——具有类似链式反应的关系。

　　DNA是整个基因组的蓝图。整个有机体的任何和所有遗传信息都与 DNA 一起存储。对于人类来说，这包括从我们的指甲长得有多快到我们的胡须是什么颜色的头发。所有这一切都取决于每个细胞中包含的基因。

　　RNA（简单地说）是一小段DNA。它是另一个核酸序列链，它从 DNA 中获取信息并使用它来制造蛋白质。DNA 到 RNA 的这一过程称为转录，它允许来自 DNA（卡在细胞核中）的信息离开细胞核并最终从信息到物质。存在三种不同类型的 RNA：信使、核糖体和转移。

　　这些蛋白质是由核糖体和三种不同类型的 RNA 在核糖体工厂中产生的。发生这种情况的过程称为翻译，然后蛋白质执行其功能（无论可能是什么）。

　　RNA 代表了这个深刻的信息库 (DNA) 和该信息的果实 (蛋白质) 之间的联系。

　　对这些核肽链进行测序，结合当前的 DNA 文献，使研究人员能够就理论与实现之间的这座桥梁收集各种见解。

　　有了这个，让我们转向 RNA 测序以及流式细胞仪如何在这个过程中发挥作用。

　　RNA测序终极指南

　　RNA 测序 ( RNA-seq ) 是一种旨在分析 RNA 内基因表达转录组的技术。这涉及到 RNA 序列的类型和数量，通过使用下一代测序来产生 RNA-seq 数据。

　　RNA seq 数据分析的步骤包括：

　　实验设置：确定您正在测量的内容

　　准备 RNA 样本

　　创建测序文库

　　RNA测序

　　分析RNA测序结果

　　第 1 步：设置

　　由于完成一个RNA seq实验需要大量的时间和精力（以及研究经费），因此正确完成设置非常重要。首先，确定 RNA 测序实验是否旨在提供定性或定量反馈：

　　定性结果——也称为注释信息，这为 RNA 测序分析提供了一种更具探索性的方法。它更有可能用于识别异常、罕见的 RNA 转录实例和异构体。它通过读取基因和基因结构来做到这一点，而不是专注于基因表达水平。

　　定量结果- 也称为差异基因表达，定量结果为您提供明确的测量值，可用于推断基因计数和相关的方差。这包括主要的三个：

　　生物学方差：对照组或治疗组之间的方差

　　抽样方差：样本中只有一小部分基因被测序

　　技术差异：由图书馆创建引起的差异

　　通过事先正确定义变量（目标转录本、效应大小、测量属性），您应该能够从一开始就确定RNA-seq数据的“相关性”。这也将允许您准备重复实验，以便获得具有统计意义的大量信息来发布有意义的结果。

　　第 2 步：准备 RNA 样本

　　设置完成后，就可以准备要测序的 RNA 样本了。这不仅仅是抓住最近的测定和移液器。这里的想法是获得一个健康、可行的 RNA链样本，该样本被分离和纯化。

　　使用（通常）两种RNA提取方法中的一种，一次一步发生这种情况：

　　固相萃取——RNA 与二氧化硅纤维结合，然后在混合回溶液之前清洗掉污染物。

　　有机萃取——利用裂解特性从细胞中分离 RNA，然后过滤掉污染物。

　　第 3 步：创建测序库

　　为了使数据和最终的 RNA-seq数据分析有意义，必须对结果进行衡量。这就是测序文库。

　　现在您有了分离和纯化的 RNA分子样本，这些 RNA 链（一旦被激活）将开始产生肽链并将氢释放到溶液中。半导体将能够测量这种反应并将信息转换为数据（0 和 1）。然后，测序文库充当每个可能反应的条形码扫描仪。

　　大多数下一代测序技术将为您构建这些文库——利用聚合酶链式反应 (PCR) 的概念来扩增样本中可用的 RNA 拷贝。

　　第 4 部分：RNA 测序

　　下一代测序技术正在迅速开发新的高效批量 RNA测序方法。大多数可用技术能够提供分析所需的 RNA 测序和数据。您选择哪一个取决于许多因素 - 但是，一旦决定，请确保您有以下可用信息：

　　无论您需要单端还是双端测序

　　每个 RNA 读取的长度

　　引发位点的引物结合 RNA 序列

　　第 5 部分：分析 RNA 测序结果

　　对基因组信息进行测序和提取可用数据确实处于现代科学的前沿，尤其是在单细胞基因组学方面。DNA 中包含的惊人数量的数据 - 在单个细胞内 - 与精神现象接近（了解有关单细胞多组学技术的更多信息）。这在单细胞 RNA seq 中得到了揭示。

　　需要生物学家、数学家、计算机科学家和统计学家来解释数据。它是“大数据”与“微生物学”的结合，操纵数据以策划可用的结果需要大量的计算能力和创造性的想象力。

　　为此，已经开发了一些关键的RNA seq 分析工具。

　　从新大会

　　将结果与单细胞 RNA 测序文库参考对齐

　　在使用任一工具之前，必须使用以下步骤处理数据：

　　解复用样本结果。通常，样本是多个测试的异质混合物（为每种混合物编码）。这些都需要解码。

　　然后从数据中删除用于编码每种混合物的适配器序列。

　　如果在某些读取中怀疑测序错误，则必须将其过滤掉或“修剪”。

　　使用统计分析工具规范化数据可以让您更好地读取数百万个数据点。

　　完成后，下面的分析工具有助于在没有已知库参考（从头）和有一个（与参考对齐）时量化结果。

　　再次组装

　　当基因组序列是新的并且没有为其构建参考时，从头组装可以帮助您构建参考转录组（因此，“从头”翻译为“从头开始”）。这个过程虽然有用，但非常棘手，因为研究人员必须手动处理变体、多态性和任何测序错误。确定什么是错误以及什么是排序的一部分使得这是一个痛苦的过程。这就是为什么，对于从头组装，您需要更长的读取时间。

　　将结果与库参考对齐

　　当 RNA 测序产生可以映射到参考库的短读数时，计算程序可以非常有效地做到这一点。在这个参考系统中，同样的错误继续出现——变体、多态性和测序错误——但是，使用统计近似，可以过滤掉其中的大部分。此外，通过操纵实验中的参数和使用不同的统计模型，您可以慢慢开始更好地分析单细胞测序数据。

　　对细胞进行分类 | RNA测序的初步“步骤0”

　　在上述步骤之前，您的工作流程中可能涉及第 0 步——对样本中的细胞进行分类。

　　同质群体的实验使分析变得更加容易，因为它从测试中删除了额外的变量。使用流式细胞仪通常归因于内部压力导致的细胞裂解和细胞凋亡。这适用于使用 20 psi 或更高内部压力的行业标准流式细胞仪。

　　然而，NanoCellect 一直在改变行业标准。他们的WOLF 细胞分选仪在小于 2 psi 的内部压力下运行，使其比下一个温和的流式细胞仪轻十倍。此外，它不会牺牲效率，而且还具有其他有用的品质，例如：

　　一次性墨盒：无需担心样品之间的交叉污染，只需换一个新的。

　　小巧便携：不到 2 立方英尺，可以放在任何实验室的工作台上。

　　直观的软件：它具有研究人员想要的所有高级功能，以及初学者需要的便利。

　　为了在处理RNA seq 分析时让您的细胞满意，请考虑使用 NanoCellect。在这里，细胞被分类、计数并保持活力。

　　资料来源：

　　NCBI 。RNA 测序：平台选择、实验设计和数据解释。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3426205/