一个值得攻读博士学位的问题：你如何可视化神经元内的蛋白质周转？

　　在攻读博士学位时，我研究了一种与神经退化有关的突触蛋白。这种蛋白质的水平在阿尔茨海默病患者的大脑中降低。但是，目前尚不清楚为什么或如何发生这种情况。因此，我开始研究蛋白质周转如何在神经元中受到调节。

　　蛋白质周转是蛋白质合成和降解的综合效应。这些过程控制着细胞中蛋白质的丰度。蛋白质丰度的稳态调节对于正常细胞功能至关重要，而且，因为我正在研究一种突触蛋白，所以我想测量它在正常神经元环境中的水平。换句话说，我需要一种在神经元中原位显示蛋白质周转的方法。

　　研究蛋白质周转的经典方法是放射性脉冲追踪实验。然而，这些实验是有问题的，因为它们需要放射性标记的氨基酸。放射性物质的使用受到严格监管，需要指定的工作区域，并且存在健康风险。重要的是，使用这种方法不可能在原位跟踪单个蛋白质的周转。

　　对于特定蛋白质的可视化，原位免疫细胞化学可能是最常见的方法。借助良好且特异性的抗体和适当的显微镜设置，我们可以观察神经元或任何其他细胞类型中一种特定蛋白质的整个群体。然而，我们无法区分该池中的新蛋白质和旧蛋白质。因此，不可能可视化蛋白质合成的定位。

　　或者，荧光蛋白标签可用于促进细胞中特定蛋白质的可视化。标记蛋白很容易从质粒中过度表达，但过度表达可能会干扰系统。另一种研究原位蛋白质合成的方法是将荧光标签敲入感兴趣的基因位点。这种替代方案的一个优点是实时成像的可能性。阿尔伯特爱因斯坦医学院罗伯特辛格的实验室最近发表了在活单细胞中跟踪翻译的技术。然而，在CRISPR-Cas9之前，这些技术相当乏味，即使在这里，也存在标签是否影响行为的问题。

　　一次会议，一次突破！

　　在我的研究生学习期间，我参加了一个名为“分子生物学视野”的科学研讨会。该年度研讨会由德国哥廷根马克斯普朗克生物物理化学研究所的国际博士生组织。我参加了这次研讨会，寻求灵感来解决在原位监测特定蛋白质的蛋白质周转的技术难题。幸运的是，我参加了前加州理工学院研究员、现任德国美因河畔法兰克福马克斯普朗克脑研究所所长Erin M Schuman教授的一次非常有趣的演讲。她提出了一项新技术，当时尚未发表，该技术允许在原位可视化特定的从头合成的蛋白质. 我有幸受邀在美因河畔法兰克福的 MPI 向他们学习并进行类似的实验。

　　使用 FUNCAT 可视化新合成的蛋白质

　　舒曼教授的技术使用非经典氨基酸叠氮高丙氨酸 (AHA) 应用代谢标记。在该技术中，AHA 被掺入新合成的蛋白质中，而不是蛋氨酸。标记的蛋白质可以使用将含有叠氮基的 AHA 共价连接到荧光炔烃标签的点击化学来检测。然后可以用荧光显微镜观察新合成和标记的蛋白质。AHA 标记的这种应用被称为荧光非经典氨基酸标记（FUNCAT，Dieterich等自然神经科学，2010 年），并允许从头显示整个 合成蛋白质组。然而，仅 FUNCAT 不能用于确定一种特定蛋白质的营业额。 舒曼教授的实验室表明，通过将 FUNCAT 与邻近连接分析 (PLA) 相结合，可以将 FUNCAT 的用途扩展到确定特定蛋白质的周转率。

　　FUNCAT与PLA的巧妙结合

　　PLA 最初是由瑞典的 Söderberg 实验室作为一种原位蛋白质-蛋白质相互作用可视化的方法出版的。在标准的 PLA 检测中，将针对两种内源性感兴趣的蛋白质的一抗添加到细胞样本中，这些蛋白质被怀疑会相互作用。两种抗体都添加了一条短的抗体特异性 DNA 链。只有当感兴趣的蛋白质彼此非常接近时，DNA 链才能参与滚环 DNA 扩增。扩增的 DNA 片段用荧光探针标记，使蛋白质-蛋白质相互作用的位置可视化。

　　为了原位研究蛋白质水平，舒曼实验室使用了改良版的 PLA，其中一种抗体针对感兴趣的蛋白质，而第二种抗体针对 AHA。现在滚环扩增只有在两种抗体识别出一种内源性目的蛋白时才会发生，该内源性蛋白在确定的时间段的脉冲标记后也掺入了 AHA 标签。因此，只有新合成的感兴趣的蛋白质被检测到，后来被 FUNCAT-PLA 可视化。

　　在结合这些方法之前，不可能原位观察特定的新合成的内源性蛋白质。现在，FUNCAT-PLA 提供有关任何细胞类型中特定内源性蛋白质转换的定量和时空信息。令人兴奋！