无论您是超级碗的体育摄影师、拍摄 X 光片的医学技术专家，还是对生命最小结构进行成像的生物学家；出色图像的关键是对比度。人类视觉系统主要依靠对比度来识别单个物体并感知我们周围的世界。没有对比，物体只会消失在噪音中。

　　由于其无与伦比的对比度，荧光成像已成为现代生物学中占主导地位的光学显微镜对比技术 ( 1 )。如果操作正确，荧光显微镜可以提供高对比度的图像，其中明亮的信号覆盖在完美的黑色背景上。除此之外，使用多个荧光团可以为图像添加第二层对比度，即颜色对比度，从而为观察者提供分子或结构特异性。最后，现代显微镜设计可以进一步利用荧光团的独特特性来阻止离焦荧光到达检测器或将荧光限制在特定的激发体积以增强空间对比度（即光学切片 ( 2 ) 或超分辨率 ( 2)3).

荧光显微镜技术

　　荧光宽场显微镜

　　荧光宽场显微镜是最常见和最简单的荧光显微镜形式。准直（非会聚或发散）激发光离开显微镜物镜，均匀照亮整个（宽）视场。向物镜返回的荧光被收集并聚焦到相机上进行可视化。以与荧光收集相反的方向照射样品称为“Epi”照射。因此，这些有时被称为落射荧光显微镜。（示例图像见上图左图）。

　　点扫描共聚焦显微镜

　　点扫描共聚焦显微镜是第一个结合光学切片的荧光显微镜技术。光学切片是指从相对较厚的三维样品中的单个薄平面提取光的能力（参见图 1）；类似于 MRI 或 CT 扫描仪。这是通过将激发光聚焦到样品中的一个点并光栅扫描该点以逐个像素地构建最终图像来实现的。收集到的荧光在到达检测器之前通过针孔。针孔经过专门放置，仅允许来自焦平面的光到达检测器，并且排除了来自上方或下方的所有光。

　　并行共聚焦显微镜（旋转盘）

　　并行共聚焦显微镜（旋转盘）提高了获取共聚焦图像的速度。逐个像素地组装图像很慢；因此，某些共聚焦显微镜使用并行化来提高性能。在旋转圆盘显微镜中，包含许多孔的金属圆盘通过激发光路旋转。每个孔对应于样品中的不同位置。由于一次照明不止一个孔，因此可以更快地获取图像。

　　2-光子显微镜

　　2-光子显微镜试图解决宽场和共焦显微镜的两个缺点。首先，宽场和共聚焦显微镜通过样品的整个轴向体积投射激发光。因此，当获取大量光学切片时，整个样品中的所有荧光团都不断地暴露在光线下，而不仅仅是焦点体积中的荧光团。这导致更快速的光漂白和信号强度的降低。2-光子显微镜将激发（和漂白）限制在一个焦点上。这是通过使用例如红光而不是蓝光来激发GFP分子来实现的. 因为红光的能量大约是蓝光的一半，所以需要两个红光光子来激发 GFP，而只需要一个蓝光光子。只有在物镜的焦点处才能建立足够高密度的红光子来实现这一点。

　　使用红光还有第二个优势：红光可以更深入地渗透到生物组织中。为了证明这一点，只需将手电筒放在手掌上即可。虽然白光进入您的手，但只能看到橙色/红色光从组织中射出。因此，2 光子可以更深入地成像到厚组织中。

　　光片显微镜

　　光片显微镜 通常利用两个或多个物镜的配置来创建激发光的薄片，该激发光垂直于收集荧光的成像物镜传播。与 2 光子显微镜一样，一次仅激发样品的一个焦平面，从而限制了光漂白。与宽场类似，整个视野一次被激发，并在一次相机曝光中被捕获。这比在共焦或 2 光子显微镜中依赖光栅扫描要快得多。

　　全内反射显微镜 (TIRF)

　　全内反射显微镜 (TIRF) 是一种仅用于激发位于盖玻片旁边的非常薄的荧光分子层的技术。光以一定角度通过盖玻片投射，使得当它到达玻璃盖玻片和水性缓冲液中的样品之间的界面时，它被完全反射。这种反射是由于玻璃和浸入样品的类水缓冲液之间的折射率不匹配而发生的。尽管激发光被完全反射，但能量通过仅在几百范围内激发荧光团的渐逝波传播到样品中纳米玻璃/水界面。

　　超分辨率显微镜

　　超分辨率显微镜允许在光学显微镜的衍射（分辨率）极限以下成像。由于光的波动性，一个无限小的光点在通过显微镜的光学器件到达检测器之前会模糊成一个 200-300nm 大小的光点。这意味着位于衍射极限内的两个或多个物体将在最终图像中显示为一个物体。在过去的二十年中，已经开发了许多允许亚衍射极限成像的技术。大多数情况下，这些技术可将光学显微镜的分辨率提高 2-10 倍（见图 1）。

　　我的实验应该使用什么显微镜技术？

　　当我考虑将哪种显微镜用于新样品时，我总是从问两个问题开始：

　　1) 样本是动态的还是静态的？

　　2) 样品是薄的（< 15 μm）还是厚的？

　　这些问题会将每个样品归入四个类别之一，每个类别都适用于不同类型的现代荧光显微镜（见表 1）。

　　薄动态样本

　　例如：具有荧光标记的活动结构的活细胞单层

　　这些样品足够薄，可以位于物镜的景深范围内（将出现在焦点上的轴向距离）。这意味着图像将显得清晰而不受模糊的离焦光线的干扰。在这些类型的样本中最难捕捉的特征是它们的快速运动。根据样本的不同，可能需要毫秒级的时间分辨率。最常见的这些实验是在荧光宽场显微镜上进行的。在这里，激发光从物镜投射，使整个视野沐浴在均匀的照明中。然后收集样品中所有染料分子发出的荧光并将其投射回快速、灵敏的检测器，例如科学 CMOS 相机。

　　如果质膜动力学是实验的主要焦点，则可以使用全内反射荧光 (TIRF) 显微镜。TIRF 仅激发盖玻片几百纳米范围内的荧光团 ( 4 )。本质上，通过滤除样品中较高荧光团的发射光来实现提高对比度的光学部分。TIRF 对样品也非常温和，因为大部分激光从样品反射回来，并且通过荧光团与渐逝能量场的相互作用发生激发。

　　通过样品的多个焦平面投射超薄激发光片的光片显微镜也可用于提供快速成像以及光学切片 ( 5 )。一个这样的例子是晶格光片，它将许多细锥形光束投射到样品中。这些光束干涉形成一个激发光的单一平面，该平面比聚焦的样品部分更薄。该技术可用于提供高 3D 空间分辨率，同时还可避免高光剂量对细胞的毒性作用。

　　薄静态样品

　　例如：固定单层细胞或薄（<15 μm）组织切片和 3D 培养物

　　这些样品不一定需要光学切片，但由于不需要高时间成像速度，因此为许多其他可以提高对比度和分辨率的技术打开了大门。标准荧光宽场显微镜可以与反卷积相结合，这是一种数学软件后处理步骤，可将失焦光重新分配到其各自的焦平面。在足够薄的样品中，由于通过更高效的相机检测器产生的光子通量更高，并且没有减光针孔，反卷积可以胜过光学切片技术。通过收集更多的光子，可以获得更高的信噪比 (6)。

　　结构照明 (SIM)、单分子定位 (PALM/STORM) 或可逆饱和光学线性荧光跃迁 (RESOLFT/STED) 等超分辨率技术在这些类型的样品上也表现出色。在超分辨率成像出现之前，光学显微镜在分辨近距离结构的能力方面受到限制。这是因为通过光学显微镜的光学系统的光会发生衍射。即使是无限小的光点——想想单个 GFP 分子——在成像时也会显示为模糊的 200-300 nm 点。超分辨率显微镜使用许多光学和化学“技巧”来打开和关闭荧光分子的子集。这可以将分辨率提高 2-10 倍，低至 10 纳米。

　　厚动态样本

　　例如：3D 细胞培养，>15 μm 的小模型胚胎

　　这些是一些最具挑战性的成像样品，因为它们需要光学切片、远距离成像和高时间分辨率。传统上，这种类型的样品使用并行共焦技术（如旋转盘共焦）进行成像。然而，由于生物组织的散射特性，可能无法进行深度超过 80-100 um 的成像。因此，依赖于深穿透红外激发光的 2 光子显微镜可以将成像深度推近 1 mm。传统上，2 光子一直是一种非常缓慢的成像技术，但扫描仪技术和并行化 ( 7 ) 的最新进展已经允许在大量 3D 体积上实时监测神经元活动。

　　除了 2 光子显微镜，光片显微镜正迅速成为许多这些样品的首选技术，因为它具有快速的时间分辨率和降低的光毒性。允许多视图成像的光片设计可以对厚散射样品进行整体成像，这是通过传统共焦无法实现的，因为上述光穿透的限制 (5)。

　　厚静态样品

　　例如：固定组织切片 (> 15 um)、3D 培养和清除组织

　　这些样品总是需要某种形式的光学切片。点扫描共聚焦显微镜（见上文）通常为此类样品提供最高质量的图像，因为它们在排除失焦光方面最有效。然而，他们还不断地用激发光从上到下对样品进行剂量，这可能导致在大轴向范围内获取多个图像时导致光漂白。2 光子成像，它限制激发和光漂白到焦平面可以用来克服这一点 ( 8 )。

　　组织清除技术 ( 9 ) 的最新发展现在允许研究人员对尺寸超过 cm 3的组织进行成像。依赖于逐个像素构建整个图像的点扫描共聚焦和 2 光子显微镜无法提供对这种尺寸的组织进行成像所需的帧速率。例如，使用 20x/1.0NA 物镜和适当的采样对整个小鼠大脑进行成像可能需要将近两个月的时间。因此，需要通过 Lightsheet 显微镜对大而清晰的组织进行成像。尽管并非所有光片显微镜都可以覆盖这种尺寸的样本，但那些可以在几个小时内对大型组织进行完整成像的显微镜。

　　尽管光学显微镜技术的现代爆炸为生物学家提供了大量工具，并为许多伟大的见解打开了大门，但对于显微镜新手来说，这可能是压倒性的。希望这个简短的概要可以帮助您指出正确的方向。在进行一组新的实验时，您当然不应该害怕向您所在机构的知名显微镜专家寻求专业知识。

　　参考

　　1. Lichtman JW，康切罗 JA。荧光显微镜。自然方法 2，910-919 (2005)。PubMed PMID：16299476。

　　2. 康切罗 JA，利希特曼 JW。光学切片显微镜。自然方法 2，920-931 (2005)。PubMed PMID：16299477。

　　3. Eggeling C、Willig KI、Sahl SJ、Hell SW。基于透镜的荧光纳米技术。生物物理学季刊评论 48 , 178-243 (2015)。PubMed PMID：25998828。

　　4. Axelrod D. 细胞生物学中的全内反射荧光显微镜。方法 Enzymol 361，1-33 (2003)。PubMed PMID：12624904。

　　5. Power RM，Huisken J。用于多尺度成像的光片荧光显微镜指南。自然方法 14 , 360-373 (2017)。PubMed PMID：28362435。

　　6. 波利 JB。生物共聚焦显微镜手册，第 3 版。斯普林格 (2006)。

　　7. 杨伟健和拉斐尔·尤斯特。神经活动的体内成像。 自然方法14.4 (2017): 349-359。PubMed PMID：28362436。

　　8. Helmchen F, Denk W. 深层组织双光子显微镜。自然方法 2，932-940 (2005)。PubMed PMID：  16299478。

　　9. 理查森 DS，利希特曼 JW。澄清组织清除。单元格 162 , 246-257 (2015)。PubMed PMID：26186186。