一. 细胞毒性测试主要检测什么？

　　细胞毒性（cytotoxicity），是指由细胞或化学物质引起的、单纯的细胞杀伤事件。它不依赖于细胞凋亡或坏死的过程和机制，并能引起细胞代谢的变化。

　　在许多生化研究领域，如药物筛选、生物材料开发、食品安全等，细胞毒性试验不仅是基本的检测方法之一，也是非常必要的指标。目前我们评价细胞毒性时，一般是检测相关指标的变化。

▲ 细胞毒性试验的常见指标[1]

　　二. 比色法细胞毒性测试方法

　　研究人员常用的细胞毒性检测方法主要有：染料排斥法、比色法、荧光检测法、化学发光法等等。选择合适的测定方法，对于获得准确可靠的结果十分重要。

　　例如，对于药物开发而言，可靠的细胞毒性测试数据，对于评估药物的有效性、伤害性、抵抗性，及其对细胞增殖、死亡等作用的影响等至关重要，甚至决定了药物开发的成败。

　　与其他方法比较，比色法具有操作简便、检测速度快等特点，适用于样本数量较多时的检测。目前常用的比色法细胞毒性测试方法如下表：

　　三. LDH法与CCK-8法比较

　　从上表中可以看出，LDH法与CCK-8法都具有染料水溶性好、细胞毒性弱、操作简单、检测时间短等优点，适合快速、高通量检测，使用的染料也基本相似。那么，这两种方法有何区别？在应用时该如何选择呢？

▲ CCK-8检测原理

　　LDH法，通过检测受损细胞膜释放的LDH量，来确定死亡细胞数。乳酸脱氢酶(LDH)，是一种稳定存在于细胞胞浆中的酶，在正常状态下，仅存在于细胞内。当细胞受到刺激死亡时，质膜发生破裂，LDH被迅速释放至细胞外（在实验中被释放到细胞培养液中），因此被作为细胞毒性研究中，使用最广泛的标记物之一。

　　CCK-8法，通过检测活细胞中脱氢酶的活性，来确定活细胞数。脱氢酶(Dehydrogenase)，是一类催化物质氧化还原反应的酶。物质经脱氢酶催化氧化，最终经过电子传递链，发生氧化磷酸化，释放出ATP，是活细胞供能以维持生存的主要途径。

　　二者相比较，LDH法在检测时直接反映了细胞的死亡率，即测定的吸光度越高，表明检测物质的细胞毒性越强。同时，LDH法也可用于细胞膜损伤实验。因其方法本身对细胞伤害较小，且不存在放射性同位素（如铬51）污染，适合在实验室进行操作。但其操作方法较CCK-8法相比略复杂，需要依据“0%细胞毒性”和“100%细胞毒性”两个对照点进行实验，其中，“100%细胞毒性”对照，对细胞完全裂解的程度要求较高。

　　CCK-8法在检测时反映了活细胞的数量，间接地显示出了细胞毒性，即测定的吸光度与细胞毒性呈反比。同时，CCK-8法也适用于细胞增殖实验。该方法稳定性和灵敏度都较高，对贴壁和悬浮生长的细胞同样适用[2]。

　　与LDH法相比，其操作方法和试剂组成更简单，在实验设计时，只需要一个对照点。但是，在使用CCK-8法测定细胞毒性时，由于其检测原理设定，有时很难判断，降低的吸光度究竟是由于活细胞数量的减少，还是细胞脱氢酶本身的活性降低。也即，影响脱氢酶活性的条件或物质，可能导致实际活细胞数与测定活细胞数间的差异。

　　在实际研究中，两种检测方法可以相互验证，更加全面地评价物质的细胞毒性。两种细胞毒性评价指标，可以使用同一批细胞同时进行验证。

　　参考文献

　　1. Istifli, Erman Salih, and Hasan Basri İla, eds. Cytotoxicity: Definition, Identification, and Cytotoxic Compounds. BoD–Books on Demand, 2019.

　　2. L Li, Y H Yang, S Wang, et al. Comparison of Cellular Activity Detection Methods. Journal of Biology, 2011, 2.