巨噬细胞属免疫细胞，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象，RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）就是科学实验中常用到的细胞系，其来源为雄性Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤。RAW264.7培养有许多注意事项，在培养过程中容易出现细胞形态改变（长出伪足）、消化困难、生长缓慢等问题。由于细胞的生长状态对实验数据是存在较大影响的，所以今天就来和大家分享一下RAW264.7细胞培养的经验。

　　一、细胞的形态与特点

　　RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，小而透亮。因为其具有较强的吞噬能力，并在吞噬抗原后释放趋化因子，促使细胞分化出伪足，粘附攀爬能力也因此增强。若细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣就会促使细胞呈现出梭形、长梭形，镜下观察就会发现细胞形态变为梭形且面积变大，不再是具有细长伪足的类圆形小细胞。这也是出现消化困难的一个主要原因。

　　二、培养注意事项和要点

　　1. 由于RAW264.7细胞易有不同形态，传代时就会发现形态变为梭形的细胞很难消化下来，轻敲培养皿细胞不会脱落，用力吹打又容易对细胞产生较大损伤，因此要尽量避免细胞发生形态改变。即在接种细胞时保持一个适中的传代密度，避免其向终末细胞分化，因为一旦细胞发生分化变为长形是无法恢复的，这是培养RAW264.7细胞时最需要注意的问题。

　　2. RAW264.7细胞喜欢连片生长，正常状态下应该是一小片一小片的分布在培养皿中，片片之间不相连接，等到长到更多更密的时才会连成大片，但同时也会叠加成层，容易出现部分细胞飘起无法贴壁的问题。所以，要关注好细胞的汇合程度，控制好细胞的生长速度，不能等到叠加成层时才去传代。

　　3. RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短，半小时左右绝大部分细胞就能够贴下去，刚贴壁时细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于培养皿中。生长一段时间后，部分细胞会变成类似四角形，伸出伪足之类的。这个时候就是在提醒你注意传代了，此时无论汇合度如何都需要进行传代了，因为形态发生改变的细胞对实验结果会产生较大影响，最终造成实验数据不理想。

　　4. 在细胞生长的初始阶段，细胞以贴壁的形式生长并呈现出长方体的形态和有“伪足”延伸。随着培养时间的增加，细胞呈现圆形并以叠加的形式生长。细胞密度达到一定的程度，会有细胞以悬浮的方式散落到到培养基中，镜下观察会同时出现悬浮和贴壁两种形态。

　　5. 该细胞传代时不需要用胰酶消化。传代时，吸走部分培养液，留下少许培养液（例如使用T25培养瓶留下2 ml），用无菌细胞刮刮拭培养表面将细胞刮落，充分吹打后接种到新的装有新鲜培养液的培养瓶内，混匀后进行培养。

　　6. 该细胞形态上包含松散贴壁的纺锤形和圆形或者立方形。当细胞密度较大时，细胞会轻微脱落变圆或者许多细胞堆积在一起，有些细胞甚至脱落漂浮。这些漂浮的细胞是存活的，在传代时应收集起来，离心后细胞沉淀可以继续培养。

　　7. 血清质量差异可能引起细胞贴壁能力变化，建议选用高质量的胎牛血清。

　　三、复苏、培养、传代和冻存

　　复苏：从液氮罐中取出细胞转移至-80℃冰箱平衡温度，准备15mL离心管根据需求加入适量预热过的完全培养基（细胞冻存悬液：完全培养基=1:6），37℃水浴锅孵育，复温后吸出细胞悬液至15ml离心管，离心去除冻存上清后，根据细胞量用新鲜培液重悬，转移至合适大小的培养皿中培养，第二天换液。

　　培养：DMEM-HD+ 10% FBS；5% CO2 ，37.0°C

　　传代：去除培养皿中的旧培养基，滴加1×PBS清洗一遍，去除PBS，加胰酶消化，随时观察消化程度，加入完全培养基终止消化（胰酶：完全培养基=1:2），收集细胞悬液离心（一般为1100转,4分钟），去除上清，根据需求确定传代比例（约1:3～1：6传代/3d），用新鲜培养基轻柔吹打重悬，铺回皿中晃匀。

　　冻存：无血清冻存液，直接放至在-80℃冰箱，注意受冷要均匀，第二天转入液氮。

　　四、具体解决方案

　　在培养RAW264.7细胞的过程中容易遇到的问题主要包括以下几种：

　　1. 复苏后存活率不高

　　2. 细胞形态发生变异

　　3. 不同形态细胞消化时间不等

　　4. 细胞生长速度缓慢