在分子生物学研究中，有很多实验需要获得目的基因的序列进而确定基因的表达水平，这就需要得到样品中高质量、高纯度的RNA，本文就RNA提取的原理、方法和注意事项进行总结。

　　RNA提取的基本原理

　　裂解过程

　　高浓度蛋白质变性剂的裂解方法，是抽提RNA的首选方案。

　　总RNA的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，而在DNA提取过程中存在的基因组与蛋白质“缠”住的问题，并不会对后续的纯化过程产生大的影响，可以不考虑。

　　高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的RNA酶，从而保证了RNA的完整性，绝大部分样品的RNA抽提方法，都是以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。

　　RNA提取

　　最近原准备去做RNA-seq，但是遗憾的是败在了RNA上，不是浓度不够，而是发现不够完整，这个时候肯定会说重新提过，多么简单，但是样品本身RNA已经降解，重新提过也枉然，肯定又会说重新取样，但是有时候就是连重来的机会都没有。

　　有一些客观原因没有办法避免，但是舍不得样品浪费，所以只好做了蛋白组，并不是说蛋白组不好，只是当现实照不进梦想，总是会有遗憾。所以这一次强行插入RNA提取。

　　RNA提取是我们一般都必备的实验技能，有很多试剂盒来提取，但是原理都大同小异，所以我们这期只探讨Trizol，试剂盒实在太多，就不一一举例了。

　　Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液，能迅速破碎细胞，其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性，抑制细胞释放出的核酸酶。随后加入氯仿，会大量地溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中，RNA则分布在上层的水相中，最后用异丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗涤沉淀，这样就可以得到比较纯净的总RNA，用这个方法提出来的RNA纯度浓度都不会太差，而且也简单易学，如果说缺点在哪里，那么某些试剂的毒性和刺激性一定要注意安全，下来我们详细探讨一下步骤。

　　实验步骤：

　　RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套口罩帽子，不要交流，打喷嚏，样品尽可能盖严。

　　1.A. 细胞。取出六孔板，弃去培养基，用预冷的PBS洗2遍，一定要把PBS吸干净。加入1ml Trizol裂解细胞，用细胞刮刮下细胞，转移到一个新的无酶1.5ml EP管中，室温静置5min（使核酸蛋白复合物完全分离）。

　　B. 组织。50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，如果你不想去称量，用匀浆器匀浆（匀浆器需要在用之前用DEPC水泡过，消毒）。转移到一个新的无酶1.5ml EP管中，室温静置5min。

　　2.加氯仿1/5 Trizol体积 ，把EP管盖子盖紧，用手上下左右晃动10次左右(摇晃时应注意离心管盖以防未盖紧使溶液漏出)，使其混匀（在室温下静置5-10 min（避免涡旋震荡，以免DNA链断裂）。然后，运用低温离心机4℃，1,0000 rpm/min，离心15min。分为3层，水相层包含RNA在上层，有机层在下层，中间层是DNA和蛋白质。

　　3.小心吸取上清液，切忌吸出白色中间层，转移至另一新的无酶EP管中。加入等体积的异丙醇（大约为500μl），用手上下摇晃，室温静置10min。低温离心机4℃，离心15min，12,000 rpm/min。

　　4.倒掉上清液，加1ml 75%无水乙醇 ，用手轻轻震动洗涤管壁，低温离心机4℃，离心5min，12,000 rpm/min，为了避免减少盐物质及碳源物质干扰，此处建议用75%无水乙醇清洗两次。

　　5.上清倒掉，放置室温（EP管倒置在滤纸上），使RNA干燥沉淀（注意不要加热干燥或离心，要不然RNA将很难溶解）。加DEPC水30μl于EP管中。

　　6.测RNA浓度：将仪器打开，先用DEPC水调零（滴加DEPC水3次调零后，并测量是否准确，这个时候千万不要为了方便只调零一次，否则在你测浓度的时候不准会发现更费时间）。吸取1-2μl待测RNA（每次我用的1.5ul，因为1ul有时候有点少，又要反复测，反而更浪费，2ul我又觉得有点多，舍不得），慢慢滴于仪器上，把RNA浓度值记录下来，以便在逆转录时使用。同时至少要记录260/280值（1.8-2.1），纯RNA的OD260/OD280的比值为2.0。

　　7.逆转录：我一直用的takara的，感觉比较好，将RNA溶液快速离心，同时将无酶EP管放于冰上，配置10μl的体系，加gDNA Eraser 1μl，5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl，RNA溶液质量根据浓度计算最好超过1μg（这个时候就知道RNA浓度的重要性了，RNA浓度最好在500-1000，这样你加的时候就会在1-2ul，不至于太少也不至于太多，如果浓度低，这个时候大家一定想起了高师姐的浓缩），最后加RNase free ddH2O至10μl，用涡旋震荡混匀。将反应液置于室温5min。加入上述变性、退火反应后的EP管中，为20μl体系：

　　轻轻混合均匀，在PCR仪上按37℃，15min，85℃，5s , hold，4 ℃，条件进行逆转录音。逆转录之后的RNA已经相对比较稳定，可以放在-80℃，我觉得用RNA来做PCR的应该会相对多一些，肯定会问只有20ul，是不是会少，不会的，在做QPCR的时候我调整了比例，都用不到1ul，而且可以做出来，所以做20多次的量如果不够，那么可能需要多加练习。

　　注意事项

　　样品的采集和保存

　　以RNA提取为目的的样品，在采样时就要根据RNA提取的实验设计进行分装，在RNAlater中保存 (推荐QIAGEN生产的)，4℃运输并过夜，以保证RNAlater充分与样品细胞结合，从而完成RNA的固定，之后转入-20℃保存，如需长期保存 (几个月以上)，应当在-80℃下保存。

　　提取过程中的注意事项

　　所有实验所用的枪头、离心管等消耗品均要使用RNase-free的；

　　整个过程要在无RNase污染的条件下进行，通常可以在无菌操作台中进行实验，并用75%的酒精进行擦拭杀菌，如有必要也可在实验前喷洒一些商用的RNase抑制剂；

　　所有相关溶液的配制要使用RNase-free水或DEPC水 (包括75%酒精也需要用无水乙醇与DEPC水配制)；

　　溶液的配制使用移液器进行操作，切勿使用量筒等中间器皿；

　　研钵、研棒、镊子、剪刀等用锡箔纸包好后，200℃干热灭菌4h；

　　实验过程中一定要戴手套和口罩；

　　异丙醇、氯仿、乙醇等试剂要使用未开封的，或者开封之后直接分装至小容量离心管的，以避免多次使用的交叉污染；

　　注1：现在一般实验室都使用从公司直接购买的RNase-free水，这种水通常都是大包装，比如100mL一瓶，在第一次使用的时候，开盖后一定要将其分装到1.5或2mL RNase-free离心管中，在冰箱中保存，每次实验用多少取多少，避免多次实验的交叉污染。

　　注2：一定要戴口罩！！！不要怕麻烦，因为你真没法保证实验过程中不打喷嚏！！！