蛋白质转印原理，大分子量蛋白转印的5个技巧

2022-06-29 10:32:22

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　　做western blot印迹膜时，较大的蛋白质众所周知是难以处理的。特别是，您可能很难实现良好的转印效率。在某些方面，蛋白质难以朝着你想要的方向前进。

　　我们将给5点建议，帮助胶上大分子量蛋白的转印。

　　牺牲胶的韧性来提高效率

　　低浓度的丙烯酰胺凝胶可能难以操作。一旦手指触摸它就会撕裂？但是，与高浓度的凝胶相比，大蛋白将更有效地从较低浓度的凝胶中移出（分辨率更好）。因此，提高你的灵活性和耐心，尝试6-7.5％的凝胶。或者可以尝试使用梯度凝胶，可以同时分辨小分子量和大分子量蛋白质。

　　去除去垢剂

　　较大的蛋白质可能在凝胶中沉淀，抑制转印。在SDS-PAGE期间添加的SDS通常会解决这个问题，但较大的蛋白质可能需要更多的SDS。您可以在转印缓冲液中添加最多0.1％的SDS以阻止沉淀的产生。因为SDS抑制蛋白质与膜的结合，因此请尝试从低浓度的SDS开始（例如0.0375％），然后逐步提高。

　　如果确实在转印缓冲液中添加了SDS，则需要重新优化其他转印条件，如转印时间和电流，以防止蛋白透过膜。

　　降低甲醇浓度

　　甲醇与SDS具有相反的作用。虽然甲醇增加蛋白与膜的结合，但它从蛋白质中剥离SDS。因此，降低转印缓冲液中的甲醇浓度也有助于防止蛋白沉淀。您可以将浓度降低到10％或更低。如果您使用的是PVDF膜，则可以完全省去甲醇。在使用之前，不要忘记用甲醇将膜激活！

　　甲醇也会导致凝胶收缩，所以如果减少甲醇，你的凝胶会膨胀得更多。这也有助于转移大分子量蛋白。但您可能需要使用比正常情况稍大的滤纸和膜。

　　慢速转印大分子量蛋白

　　大分子量蛋白想要获得良好的转移效率可能需要更多时间。快速移动那些大分子可能很困难。尝试以较低的电压过夜转印。只是不要忘记保持转印要在低温环境！

　　使用湿转

　　虽然半干转印可能更适合设置并且需要较少的缓冲液，但它确实有其缺点。半干转印通常比湿转移效率低，并且不能增加转印时间以适应更大的蛋白。转移大蛋白时最好坚持使用湿转。

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