什么是稳转株？

　　稳转株即稳定表达的细胞株，指基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系。

　　为什么要建立稳转株？

　　① 通过建立稳转细胞系，可以降低频繁转染或者病毒包装的成本，方便在目的细胞中研究基因功能实验研究；

　　② 区别于瞬时转染只能干扰表达，无法去除已表达的目的蛋白，构建稳转细胞系可以实现更好的基因干扰效果；

　　③ 瞬转会引入极高拷贝数的表达，导致因人为因素造成实验结果的不精确，建立稳转细胞系可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究；

　　④ 需要用诱导表达系统的，主要是一些致死基因或者是需要时空表达的。

　　稳转株构建原理

　　通过将外源DNA/shRNA克隆到带有某种抗性基因的载体上，重组载体被转染至宿主细胞并整合到其染色体中，并能随细胞分裂稳定传递下去，再用载体中所含抗性基因进行筛选。

　　稳转株构建方法

　　目前常用到的方法有脂质体转染和病毒转染，病毒有慢病毒（Lentivirus），腺病毒（Adenovirus），逆转录病毒（Retrovirus）。

　　影响稳转株建立的因素

　　① 外源基因的整合率：决定了稳转株筛选的难易程度；

　　② 插入外源基因片段的拷贝数：通常低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；

　　③ 整合位点的转录活跃度：决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；

　　④ 外源基因片段整合到细胞后的稳定性：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象。

　　稳转株建立步骤

　　| 病毒法

　　① 确定目标细胞系的相关信息，细胞的培养条件，细胞的增值速度，支原体污染情况；

　　② 预实验确定MOI值，可通过查阅文献确定慢病毒在目标细胞系中的MOI值也可参考查阅得到的数据，设计梯度实验，摸索最适MOI；

　　③ 预实验确定筛选药物用量，常用的药物筛选有：puro、G418、潮霉素等；

　　④ 细胞铺板，将需要的细胞量接种于合适的培养皿中；

　　⑤ 细胞感染，通过接种的细胞量及预实验得来的MOI来计算添加的病毒体积；

　　⑥ 撤病毒，第二天，一般不超过24h换液；

　　⑦ 转染48h后选择对应的抗性药物进行筛选；

　　⑧ 筛选结束后进行单克隆化，选择阳性克隆进行培养。

　　| VIRUS-Free™技术

　　VIRUS-Free™ 是一种利用转座子系统进行细胞稳转株的构建和筛选的技术，以替代慢病毒感染构建稳转细胞株的技术。其载体中包括了转座子的识别区域，在转座酶的催化下，将目的片段从载体上或者BAC分子上切割下来形成一个小环结构，并在基因组里面的固定序列位置进行插入，从而实现稳转。目前已经在CAR-T细胞治疗中得到较多的临床应用，并充分体现出其：低成本、高效率、基因表达稳定的特点。