细胞划痕实验（Wound Healing）是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外实验方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上划痕工具制造一个空白区域，空白区域的细胞被机械力去除掉了，通过一段时间的培养，观察细胞向无细胞区域迁移的情况，通过测量细胞的迁移距反映细胞的迁移能力。

　　细胞划痕实验的用途及优点

　　用途：肿瘤细胞运动常用研究方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。基本的步骤包括“划痕”的制造，细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。

　　细胞划痕实验结果与分析

　　优点：

　　1.在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。

　　2.非常适合研究细胞与胞外基质（ECM），细胞与细胞之间相互作用引起的细胞 迁移。

　　3.与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。

　　4.研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。

　　Culture Insert方法

　　1.准备细胞，培养液，culture Insert。

　　2.如图，将细胞接种于Dish中间的Insert，细胞长满Insert 区域后用镊子移除Insert即可产生500μm宽度的划痕。

　　3.每隔4-6小时拍照记录。

　　4.根据收集图片数据分析实验结果。

　　传统实验方法

　　实验材料：

　　1.细胞培养平板，一般使用 6 孔板，大小合适，便于划线和观察；

　　2.marker 笔，用于观察是标记；

　　3.直尺，用于观察时对细胞划痕宽度测量；

　　4.20 微升枪头（灭菌）或者经过灭菌处理的牙签均可，用于在单层细胞上划痕；

　　5.无血清培养基；

　　6.PBS。

　　注：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）

　　实验步骤：

　　1.培养板划线

　　首先使用 marker 笔在 6 孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔 0.5~1cm 一道，横穿过孔。每孔至少穿过 5 条线。划线时注意线不要太粗 。

　　2.铺细胞

　　在孔中加入约 5×105 个细胞（不同的细胞数量有所不同，根据细胞的生长快慢调整），接种原则为过夜后融合率达到 100%。

　　3.细胞划线

　　第二天用枪头或者无菌牙签，垂直与细胞平面，沿着头一天划在平板背面的线在细胞层上进行划痕(不同孔之间最好使用同一只枪头或牙签)。

　　4.洗细胞

　　划痕完成后，使用无菌 PBS 洗细胞 3 次，洗去不贴壁的细胞，即划线时划线的细胞，是划线后留下的间隙清晰可见，然后更换新鲜无血清培养基。

　　5.细胞培养、观察

　　将细胞放入 37℃ 5% CO2培养箱，培养。然后在适当的时间点，如 0，6，12，24h 取出细胞，显微镜线观察并测量划痕的宽度，并拍照(具体时间依实验需要而定)。

　　6.结果分析

　　使用 Image J 软件打开图片后，随机划取 6 至8 条水平线，计算细胞间距离的均值。

　　注：1、实验时，选择适当的细胞贴壁率；2、划线后，通常采用无血清或低血清（ ＜ 2%）的培养液。

　　注意事项

　　1.铺细胞最好使用 6 孔板，因为 6 孔板可以保证有相当距离的平直划痕，而且因为有5 条定位线，与划痕相交，这样就有 10 个可固定监测点，不作重复，误差也很小。

　　2.如果你连续监测 24 小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素（1 μg/ml）处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。另外，使用无血清培养基也可以降低增殖对实验结果的影响。

　　3.照片拍完之后，可以用 image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。

　　4.虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。