胶回收和PCR 产物回收技巧(PCR 产物回收的详细方法和步骤)

　　1、提高胶回收量的技巧

　　1) 增加电泳时的上样量。

　　2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。

　　3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。

　　4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。

　　5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。

　　6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性(电荷)和疏水性使DNA与柱子结合。

　　因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul(PH 5.0，3mol/L的 NaAC);为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30%异丙醇在加热溶解胶后的液体里。

　　7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟(大约需10分钟)，以使乙醇充分挥发。

　　8) 最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱(不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱);洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。

　　9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。

　　10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。

　　2、PCR 产物回收的详细方法和步骤

　　1) 普通胶回收

　　如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可以切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚/氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。

　　2) 从低熔点凝胶回收DNA

　　纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE(10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA )，置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。

　　待放至室温，加等量酚(TE饱和，TE封在上层，取下层酚)，轻轻混匀(不用混匀)，12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。

　　取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用(可用于目的基因结构分析，探针制备等)。

　　3) 扩增特异性好的PCR回收

　　如果PCR扩增特异性好，只是简单的PCR产物纯化回收，可以在PCR产物中加入50ug/ml 的蛋白酶K，37度1h，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1体积的醋酸钠，2.5体积的无水乙醇沉淀回收。