【细胞培养】贴壁细胞培养基的选择与使用

　　一、复苏

　　复苏细胞要快速解冻

　　1、水浴锅加热至37℃。

　　2、冻存管从液氮或者深度冰箱中取出，立即投入37℃，轻轻晃动至融化取出，酒精棉球擦拭后放入超净工作台内。

　　3、使用移液器吸出细胞悬液至装有10ml培养基的离心管中，1500转/分钟，5分钟。整个操作速度尽量要快，以减少细胞在含有冻存液的培养基中存放的时间。

　　4、移液器吸取上清液，加1ml培养基重悬细胞后，将细胞悬液加入5ml培养瓶，培养瓶加培养基至5ml。操作过程尽量轻柔。

　　5、在培养瓶侧面标记细胞品种、实验日期等，放置细胞培养箱中培养，隔日观察细胞是否贴壁成活。

　　二、培养基

　　培养基的选择依细胞种类而定。贴壁细胞一般使用DMEM培养基。

　　1、DMEM-高糖（标准型）

　　含葡萄糖4500mg/L，适用于许多哺乳动物细胞培养，更适合高密度悬浮细胞培养。附着性较差，但是又不希望它脱离原生长点的克隆培养，也能够用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养。

　　2、DMEM-低糖（标准型）

　　含葡萄糖1000mg/L，用于许多哺乳动物细胞培养。低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快，附着性较差的肿瘤细胞的培养。

　　3、DMEM/F12

　　DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有很多微量元素，和DMEM以1:1结合，称为DMEM/F12培养基（DMEM/F12medium），作为开发无血清配方的基础，这就利用了F12含有较为丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。DMEM/F12培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞的培养。后来经过改良，在DMEM/F12（1:1）中加入15mMHEPES缓冲液，以增加其缓冲能力。

　　三、血清

　　一般选用血清种类可以根据ACTT及实验需求来选择。

　　1、我国对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中突出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。血清分为：

　　a) 新生牛血清（新生的小牛10-14天内取血）；

　　b) 小牛血清（10个月内的小牛取血）；

　　c) 胎牛血清（剖腹取出胎儿制成的）。

　　2、三种血清之间的区别：

　　三种血清的成份，总体没有明显差别。胎牛血清品质最高。胎牛血清与新生牛血清所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组分与比例不同。因为生长发育的需要，有些成分在小牛出生后会发生一些变化，胎牛血清中的部分功能蛋白与小牛血清中的含量有差别。

　　3、血清保存和使用的注意事项

　　血清应保存在-5℃至-20℃，若存放4℃不可超过一个月。解冻血清时，应先将血清置于2-8℃冰箱，并经常摇匀使之溶解，然后至室温放置使之升温，不可直接置于37℃水浴锅或温箱中。如若放在37℃解冻，颜色加深，粘稠度也增加，血清在解冻和热灭火后，按用量分装，-20℃保存，使用时避免反复冻融。

　　四、传代

　　1、实验准备，超净台喷洒酒精，紫外照射30min。准备好培养瓶/皿，离心管，10%DMEM，0.25%胰酶，D-hanks液等，带上手套，口罩等。

　　2、倒去旧培养基，用D-hanks液清洗一遍，去除沉积的死细胞等。

　　3、加入2ml 0.25％胰蛋白酶消化液，消化2～3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。

　　4、加入1～2滴管含有血清的培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。

　　5、以1：2或1：3进行分装，补充新鲜培养基，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。

　　6、细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。

　　7、贴壁细胞的生长必须仔细监测以确保细胞保持健康。根据细胞类型，很多贴壁细胞在其达到70-90%密度，也就是覆盖了培养容器表面的70-90%时需要传代。这些细胞系虽然保留了原细胞源的很多特征，但是每次传代也会使它们开始产生一些扩增细胞的特有特性。因此，对任何一个特定细胞系，要考虑限制传代的次数。

　　8、很多贴壁细胞系可天然附着于无涂层的塑料上。因此，塑料细胞培养板如培养皿或六孔板经常用于传代细胞。塑料的细胞培养瓶也经常用到，如T25的细胞培养瓶，常用于扩增培养数目少的细胞或者开始培养生长缓慢的细胞系。T75细胞培养瓶常用在培养扩增速度较快的细胞系或用于生长超过T25培养瓶容量的大量细胞。

　　9、在转移贴壁细胞时，要先剪切掉细胞上与和塑料结合的蛋白。因此，消化酶胰酶常用于消化细胞。控制胰酶消化的时间很重要，因为如果处理时间过长会损坏细胞表面的蛋白。

　　10、细胞培养液能中和胰酶。所以在胰酶消化前常用磷酸缓冲液或PBS洗涤细胞。EDTA，一种钙螯合剂有时候也用于提高胰酶的蛋白水解功能。

　　11、为扩增细胞克隆，将新鲜传代的细胞培养于细胞培养箱中，选择适合该细胞生长条件，通常为温度37度，二氧化碳5％和湿度95%。