细胞回收率除了与解冻细胞过程有关，也与冷冻过程以及使用之抗冻液有很大的关系。细胞在冷冻过程中会遭受许多压力，包含渗透压、自由基、休眠代谢等，导致多数细胞在冷冻或解冻过程中死亡，敏感的干细胞更是难以存活。除了这些压力之外，在操作过程中的细节亦可能成为回收率不佳的杀手。在冷冻及解冻的过程中应该注意哪些细节来增加细胞的存活率呢?

　　1. 解冻细胞时，为什么细胞的存活率都不好?

　　解冻细胞时要掌握快速解冻的诀窍，而冻细胞时则要掌握缓慢冻结细胞之诀窍。解冻细胞要快是因为要防止冰晶再形成而伤害细胞。存活率不好要先确定解冻细胞时之流程是否快狠准，再来冻细胞溶液中的 DMSO 会伤害细胞，若一开始没有离心去除，最好在解冻细胞完后 8-12 小时(若为贴附细胞，要先确定细胞已贴盘)再次更换新鲜培养液。除此之外也有可能是冻细胞时操作不当造成细胞在冻细胞时就已死亡。

　　2. 解冻细胞存活率不好，若是冻细胞时的问题?

　　冻细胞前要先确定细胞处在生长旺盛的 log phase，且需先检测细胞是否还保持其性质，例如，是否还有抗体或蛋白质产生，冻细胞时的细胞浓度要在 1~5 x 10^6。再来是抗冻液之比例，DMSO约为 5-10%，其他种抗冻液则依照说明书使用。抗冻液主要用途是放慢冰晶产生之速度，避免冰晶刺破细胞膜，伤害细胞。冻细胞时需缓慢降温也是要避免冰晶快速产生造成细胞伤害，而在 4 度到-20 度这个过程建议不要超过 1 小时，以防止冰晶过大，伤害细胞。

　　3. 为什么使用 Trypsin 有些细胞很快就下来，有些无法打下来?

　　每株细胞特性皆不相同，无法使用单一 protocol 处理。第一次使用 trypsin 时，最好观察此株细胞对 trypsin 的耐受程度，若细胞很快就被切断 ECM 键结，则之后加入 Trypsin 后可在室温作用，避免在 37 度中作用对细胞造成伤害。若细胞打不下来，则可以放置 37 度作用约 5 分钟，不要放太久，避免伤害细胞。除此之外要注意的是，在加入 trypsin 之前是否有使用不含钙镁离子的 PBS 或DPBS 将旧的培养液清洗干净，因旧的培养液中会中和 Trypsin 之作用，钙镁离子也会与 Trypsin 结合，造成 Trypsin 无法作用。