冷冻保存是一项成熟的实验室技术，在接近液氮（-196°C）的温度下存储细胞和其他生物材料。它为研究人员提供了备用，以防止因污染而失去正在研究生长的细胞，并通过允许在当前培养物长时间生长后启用早期传代细胞来最大程度地减少遗传变异的发生。我们讨论了冻存和复苏细胞以保持高细胞活力的实践经验。

　　冷冻前检查细胞健康

　　理想情况下，当细胞特性由于延长传代而几乎没有时间改变时，应以低传代次数冷冻细胞。冷冻细胞之前，重要的是使用台盼蓝或其他染色剂进行活力计数，并通过无菌评估和支原体测试检查污染。

　　在对数生长期以适当浓度冷冻细胞

　　冷冻前1-2天传代细胞或使用新鲜的培养基，可确保细胞健康并处于活跃的生长阶段。例如，理想情况下，冷冻收获后贴壁细胞的融合度应达到70-80％左右。冷冻细胞的浓度在不同培养物中可能有所不同，但在冷冻培养基中通常为1x106–5x106细胞/ml。太低或太高的密度冷冻细胞会影响细胞的生存力，应避免。

　　使用合适的冷冻介质

　　冷冻保存培养基通常包含细胞生长所需的培养基，冷冻保护剂（例如DMSO或甘油）和少量的蛋白质来源（通常是血清）。尽管防冻剂对于防止冻融过程中的细胞应激至关重要，但可以省略血清。要避免使用血清的情况下，可以用无血清条件培养基或10％细胞培养级BSA补充生长培养基成分。

　　尽快开始冻结过程

　　为了保持活力，应在将冷冻培养基引入细胞后立即开始冷冻过程。在将冷冻剂转移到冷冻容器中之前，先将其放在湿冰上可以加快此过程。

　　缓慢冷冻细胞

　　缓慢冷冻细胞对于防止细胞内冰的形成至关重要，可以使用冷冻速度为1°C/分钟的冷冻容器来实现。应将其在-80°C下放置至少4小时，但理想的情况是，一旦添加了含细胞的冷冻管，应放置过夜。不含异丙醇的冷冻系统避免了常规酒精替代品的成本和不便，并提供了更均匀的冷冻效果，以保持细胞活力。

　　在转移到液氮之前检查冷冻的细胞库存

　　将细胞冷冻至-80°C后，在将剩余的样品转移至液氮之前，牺牲其中一个样品以确认细胞种子是可行的且未被污染的操作是有帮助的。但是，将细胞长时间置于-80°C会影响细胞健康，因此在完成检查后应尽快转移至液氮中。

　　将细胞储存在液氮的气相中

　　细胞应储存在液氮的气相中，以防止液体进入试管。这不仅会导致污染，还可能导致小瓶因融化后膨胀而失效。

　　复苏使用前确保细胞保持冷冻

　　为防止损害细胞活力，切勿将冷冻保存的细胞从液氮转移到实验室。必须始终使用干冰或液氮容器，尤其是要在相当长的距离或时间内运输细胞时。

　　快速解冻复苏细胞

　　从液氮储存器中取出细胞后，应将冷冻管置于37°C水浴中，直到将内容物解冻为止。然后应立即将细胞转移至大量预热培养基中，并滴加更多敏感细胞类型（干细胞，原代细胞）以保持活力。尽管某些细胞可以通过离心沉淀后再用移液管轻轻重悬，然后添加到装有预热生长培养基的细胞培养瓶中，但对于其他类型的细胞，最好（更温和的）将细胞解冻后直接转移到摇瓶中并在第二天进行培养基更换，以去除任何残留的冷冻保护剂。

　　确认最近复苏的细胞是健康的

　　快速的目视检查可以提供细胞健康的早期指示，例如确认粘附的细胞已附着在烧瓶上。初次传代时，任何观察都可以通过可行性检查得到支持。