细胞死亡的方式主要有两种，包括细胞坏死（necrosis）和细胞凋亡（apoptosis）。细胞坏死是早已被认识到的细胞死亡方式，而细胞凋亡是近年来逐渐被认识且越来越受到重视的细胞死亡方式。两种死亡方式最重要的区别是细胞坏死会释放出细胞内溶物，引起炎症反应，而细胞凋亡不会暴露细胞内溶物，一般被吞噬细胞吞噬清除，不引起炎症反应。

　　细胞凋亡，也称细胞程序性死亡，是指在一定的生理或者病理条件下，细胞主动的、高度有序的、自己结束其生命的过程。细胞凋亡是生物体中一种普遍存在的现象，胚胎形成、个体发育、衰老和损伤细胞的清除等都与细胞凋亡密切相关。细胞凋亡在免疫学中也非常重要，如T细胞在胸腺内发育的过程，经过阴性选择和阳性选择后，95%的胸腺细胞发生凋亡，只有5%的胸腺细胞发育为成熟T细胞进入外周。

　　检测细胞凋亡的方法很多，如电子显微镜或者光学显微镜下的形态学观察、细胞DNA提取物的DNA梯状带电泳实验等。而流式细胞术是非常重要的检测细胞凋亡的方法，不仅可以定性，也可以定量。流式细胞术检测细胞凋亡的方法也有很多，其中最重要是annexinV/PI双染色法。其他的还有SYTO/PI双染色法、细胞DNA含量分析法、线粒体损伤检测法、活化的caspase-3检测法、FLICA标记法、甲酰胺诱导ssDNA单抗检测法、TUNEL法等。

今天主要介绍一下annexinV/PI双染色法。

　　Annexin V/PI双染色法

　　正常细胞膜的磷脂分布是不对称的，活细胞中磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS）位于细胞膜的内表面，细胞凋亡时，细胞膜发生变化，PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。annexinV是一种对PS有高度亲和力的、钙依赖性的磷脂结合蛋白，annexinV可以特异性地识别凋亡细胞表面的PS，而活细胞的PS位于细胞膜的内表面，无法与annexinV特异性结合。所以可以用FITC偶联的annexinV鉴别凋亡细胞和活细胞。

　　坏死细胞的PS也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面，annexinV也能识别坏死细胞表面的PS，所以annexinV无法区分坏死细胞和凋亡细胞。而PI染料能够与细胞内的DNA结合，区分坏死细胞和活细胞。凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合，所以PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞，而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合，坏死细胞内PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光，被FL2或FL3通道接收。所以annexinV和PI同时使用，就可以区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，这就是annexinV/PI双染色法检测细胞凋亡的原理。

　　标记方法与常规标记荧光抗体的方能一样：加入适量的FITC­annexinV和PI，4℃静置30min即可。注意标记PI的方法与PI染色检测细胞内DNA含量的方法不同，不需提前固定细胞，因为本方法标记PI是为了检测细胞膜的通透性从而鉴别细胞是活细胞还是死细胞，而用PI检测DNA含量时必须先破坏活细胞的细胞膜的完整性使PI进入细胞内与DNA结合。

　　下图是用annexinV/PI双染色法检测细胞凋亡得到的一张散点图。图中大致可以分为三大细胞群：右上象限的细胞表型为annexinV+PI+，代表的是坏死细胞；右下象限的细胞表型为annexinV＋PI-，代表的是凋亡细胞；左下象限的细胞表型为annexinV-PI-，代表的是活细胞。通过annexin V/PI双染色法可以非常明确地区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并且可以定量分析各自所占的比例。

　　例：

　　下图引自［1］，作者用annexinV/PI双染色法检测人肺癌细胞系“H1299”和“A549”细胞凋亡，证明人肺癌细胞表面的TLR4受体与LPS结合后，能够增强其抵抗TNFα和TRAIL诱导的凋亡。

　　从图中可以看出，TRAIL诱导后，H1299人肺癌细胞系的凋亡比例从3.36%上升到13.7%，被TNF-α/CHX诱导后，凋亡比例上升到16.9%；如果在诱导前加入LPS，活化H1299表面TLR4信号，被TRAIL诱导后凋亡比例只有3.8%，被TNF-α/CHX诱导后凋亡比例只有3.93%,说明H1299表面TLR4信号的活化能够促进其抵抗凋亡。另一个人肺癌细胞系A549的结果也相似，LPS活化TLR4信号后，TRAIL诱导凋亡比例从16%下降到3.09%，而TNF-α/CHX诱导凋亡比例从17%下降到11.8%。

　　［1］Weigang He, Qiuyan Liu, Li Wang, et al. 2007. TLR4 signaling promotes immune escape ofhuman lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Molecular Immunology, 44:2850-2859.