您洗手了吗？

　　您穿戴个人防护设备了吗？

　　细胞培养应该怎么做？

　　下面列出了几乎所有人都需要注意的细节，大家可以对照自己的操作和习惯进行检查！

　　工作区域

　　1.细胞培养通风橱设置是否正确？

　　2.细胞培养通风橱所在区域有无气流和直接出入通道？

　　3.工作台面是否整洁？

　　4.是否仅仅放置了实验所需的物品？

　　5.开始工作前用70%乙醇擦拭工作台面了吗？

　　6.是否定期对培养箱、冰箱、冰柜及其他实验设备进行清洁和消毒？

　　个人卫生

　　1.您洗手了吗？

　　2.您穿戴个人防护设备了吗？

　　3.如果您留了长发，头发是否扎在后面了？

　　4.您是用移液器操作换液吗？

　　5.试剂和培养基

　　6.您采用适当的方法对实验室中配制的所有试剂、培养基和溶液进行灭菌了吗？

　　7.在将容器、培养瓶、培养板和培养皿放入工作台面之前，您用70%乙醇擦拭其外部了吗？

　　8.试剂瓶、培养瓶及其他容器不使用时盖紧了吗？

　　9.是否已将所有培养板均放入无菌重复密封袋中？

　　10.是否有试剂外观浑浊？是否污染了？试剂中是否有漂浮颗粒吗？有难闻气味吗？有颜色异常吗？如果出现上述情况，是否已对其进行去污或丢弃？

　　操作

　　1.您操作时是否缓慢、谨慎、注意无菌技术？

　　2.在将移液器、试剂瓶和培养瓶放入细胞培养通风橱之前，用70%乙醇擦拭其表面了吗？

　　3.是否将盖子口朝下放置在工作区域？

　　4.您是使用无菌玻璃吸管或者一次性无菌塑料吸管操作液体吗？

　　5.无菌吸管是否仅仅使用一次以免交叉污染？

　　6.您是否注意到避免使吸管尖端触碰到任何非灭菌物品包括瓶口螺纹的外缘？

　　7.发生液体泼溅时是否立即吸干并用70%乙醇擦拭该区域？

　　需要特别提示的是

　　超净台桌面物品的摆放和设置，以及个人卫生如女生飘飘的长发等方面是很容易被忽略的，超净台上摆的东西太多，会对风向和风压造成干扰，需要大家注意。

　　细胞培养污染分类

　　细胞培养污染主要分为两类，一是化学污染物，例如：培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂和去污剂。二是生物污染物，例如：细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉污染。

　　细胞污染

　　细菌外形多样，可呈球状、杆状和螺旋状。细菌和霉菌一起构成了细胞培养中最常遇到的生物污染物。细胞被细菌污染后，往往一两天内即可通过简单的肉眼观察发现，培养基的pH值也会突然降低。下图为贴壁生长的293细胞被大肠杆菌污染。

　　霉菌污染

　　霉菌污染初期培养物的pH值会维持稳定，污染加重后pH值会迅速升高，导致培养基浑浊。在显微镜下，菌丝通体常呈细束状纤维，有时呈较为密集的孢子团块。孢子在休眠期可以耐受极端严峻、不利的环境，因此当霉菌污染时，一定要果断及时扔掉细胞，防止在敷箱内大规模污染。

　　酵母污染

　　与细菌污染类似，培养基被酵母污染后也会变得浑浊，特别时进入污染后期时。培养物被酵母污染后pH值变化极小，污染严重时才会升高。在显微镜下，酵母呈单个卵圆形或球形颗粒，有些会芽生出叫嚣的颗粒。下图为被酵母污染的293细胞。

　　病毒污染

　　病毒体积极小，因而要检测有误病毒以及将其从细胞培养所用的试剂中去除都十分困难。由于大多数病毒对宿主有非常严格的要求，因此一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响。但是，使用病毒感染的细胞培养物时却会对实验操作者造成严重的健康威胁。

　　支原体污染

　　支原体被认为时能够自我复制的最小生物。由于体积极小，支原体的检测十分困难，除非达到极高的密度，否则再次之前往往没有明显的感染征象。有些支原体甚至会在培养物中持续存在，而不导致细胞死亡，但是这些支原体会改变培养体系中细胞的行为和代谢。慢性支原体感染的可能表现包括：细胞增殖速度降低、胞核密度下降以及悬浮培养的细胞凝集。切实有效的检测支原体污染的方法就是荧光染色、ELISA、PCR、免疫染色、放射自显影或者微生物学测定技术定期检测培养物。

　　交叉污染

　　虽然不如微生物污染普遍，但是许多细胞系与HeLa细胞及其他生长迅速的细胞系间广泛的交叉污染是一个明确的问题。从声誉可靠的细胞库获取细胞系、定期检查细胞系的性质以及采用良好的无菌技术是有助于避免交叉污染的惯例方法。

　　抗生素的使用

　　细胞培养的时候不应常规使用抗生素，因为联系使用抗生素会促进耐药菌株的产生，导致轻度污染持续存在。一旦将抗生素撤去，这种轻度污染最终将发展成为大规模污染，而且连续使用抗生素还会掩盖支原体感染及其他污染。因此，抗生素只能作为对付污染的最后手段，而且只能短期使用，并应尽快撤除。