一、编号：JS0602

　　二、标题：单细胞悬液制备操作规程

　　三、关键词：单细胞悬液 操作规程 流式细胞术

　　四、目的：规范单细胞悬液制备的操作

　　五、背景知识：单细胞悬液的制备是流式细胞术的前期准备工作之一。

　　六、原理：实体组织制备单细胞悬液可用酶消化、机械法。

　　七、材料：0.25%胰酶，0.01mol/L PBS，300目尼龙网，0.04%EDTA液，红细胞裂解液（氯化铵4.16g，碳酸氢钾0.5g，EDTA·2Na0.02g，溶于500ml蒸馏水）。

　　八、操作步骤

　　(一)实体组织单细胞悬液的制备

　　1、酶消化法

　　⑴选取的组织立即放入预冷的组织培养液或PBS中，清洗血迹及其它污染物。去除组织块中的块死成分、纤维、脂肪及血管（专门制备相关细胞时除外）。

　　⑵ 用眼科剪将组织块剪成1mm3左右小块，放在预冷的组织培养液或PBS中并进行漂洗，洗去剪碎的细胞碎片。

　　⑶ 加入适量酶消化液，37℃恒温水浴消化20～30min，期间进行间断振荡或吹打细胞。

　　⑷ 用冷培养液或PBS终止消化，用300目尼龙网过滤除去组织团块，收集滤过的细胞，500g离心10min后去上清，并用PBS洗1～2次。细胞计数总数不少于106个细胞。

　　⑸ 如果下一步做DNA含量分析，则将细胞悬液用70%预冷乙醇4℃固定。如果做免疫荧光测定，则不用乙醇固定，须尽快染色后上机检测。

　　2、机械法（网搓法）

　　⑴ 前处理同酶消化法⑴、⑵步。

　　⑵ 将300目尼龙网扎在小烧杯上，将剪碎的组织放在网上，以眼科镊或刮刀轻搓组织块，边搓边以PBS冲洗，直至将组织搓完。

　　⑶ 收集细胞悬液，500g离心10min后去上清，并用PBS洗1～2次。细胞计数总数不少于106个细胞。

　　⑷ 同酶消化法⑸步。

　　(二)血液白细胞悬液的制备

　　取肝素抗凝全血100μl，加红细胞裂解液3ml，振荡混匀后静置10min，500g离心10min，去上清，再加红细胞裂解液3ml，混匀后500g离心100min，去上清，加PBS洗2遍后备用。

　　九、注意事项

　　1、除酶需要保持一定温度获得最好消化效果外，其它操作时液体需在4℃冰箱中预冷以减少对细胞的损伤。

　　2、不同组织制备单细胞悬液需参考文献选用相对应的分离方法，部分组织制备单细胞悬液需采用其它方法（如肝细胞、软骨细胞等）。