一、编号：JS0603

　　二、标题：单细胞凝胶电泳操作规程

　　三、关键词：单细胞凝胶电泳 操作规程

　　四、目的：规范单细胞凝胶电泳的操作，提高单细胞凝胶电泳试验结果的可比性。

　　五、背景知识：单细胞凝胶电泳分析（single cell gel eletrophoresis，SCGE）是由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，能够灵敏地检测DNA断裂，在检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面有广泛的应用价值。因其细胞电泳形态颇似彗星，又称彗星实验（comet assay）。

　　六、原理：在细胞核中，DNA是环状附着在核基质上，细胞裂解过程中，核基质被溶解、抽提，DNA的结构则未发生变化。如果DNA链上存在缺口，则使DNA超螺旋变的松弛，DNA环向外展，同时由于暴露了阴电荷，在电场力的作用下，松动的DNA环向阳极迁移，但是由于这种松动的DNA环一端仍附着于核DNA，其迁移距离受到限制，因此尾长并不总是真实反映链缺口的多少。实际应当依靠尾长与尾部的荧光强度同时来进行分析。

　　七、仪器设备和材料：琼脂糖，低熔点琼脂糖，磨沙载玻片，水浴锅，碘化丙啶（Sigma），电泳仪，水平电泳槽，荧光显微镜（BX60，奥林巴斯）。

　　八、操作步骤

　　1、分离制备单细胞悬液

　　(1)体外培养的细胞株：用胰酶消化，吹打成单细胞悬液。

　　(2)体内脏器细胞：处死动物，取出脏器，于Hank’s液中制备成单个细胞悬液。

　　2、胶板制备

　　(1)取20~50μl于56℃水浴中保温的0.5%普通熔点琼脂糖，铺于磨沙载玻片上，形成底胶。

　　(2)取100~150μl 0.5%普通熔点琼脂糖加在底胶上，再于其上加盖玻片，4℃冷凝10分钟。

　　(3)取下盖片，取50~100μl于37℃水浴中保温的1.0%的低熔点琼脂糖与50~100μl细胞悬液（105个细胞/ml）混匀，立即铺片，加上盖玻片，4℃冷凝10分钟。

　　(4)去掉盖玻片，取70~100μl于37℃水浴中保温的0.5%的低熔点琼脂糖铺片，加盖玻片，4℃冷凝。

　　3、细胞裂解与电泳

　　(1)将制备好的胶板去掉盖玻片后，浸于4℃预冷的细胞裂解液中，4℃裂解1小时。

　　(2)取出胶板，放入电泳槽中，浸泡在电泳液中解旋20分钟。

　　(3)4℃电泳20分钟（25V，300mA）。

　　4、中和与染色：

　　(1)电泳结束，将胶板浸泡于中和液中，每次15分钟，共中和两次，注意更换中和液。

　　(2)取出胶板，置于染色架上，滴加5μg/ml的PI，暗处染色20分钟。

　　(3)蒸馏水脱色15分钟。

　　5、镜检和分析：

　　(1)在荧光显微镜下观察，绿光激发吸收滤片590nm，必要时照相记录。

　　(2)记数观察的细胞，记录彗星细胞出现的频率，用目镜测微尺测头长与全长，计算核DNA迁移距离。