一、实验步骤详解

　　（一） 配胶

　　1. 洗玻璃板：用洗洁精洗净，再用蒸馏水冲洗后，使用无水乙醇进行润洗，放置，自动晾干（或使用吹风机吹干）。

　　2. 配置分离胶：制备 5 ml/gel的分离胶，用合适规格的移液枪吸取 1.9 ml/gel DDW、1.7 ml/gel 30% Acr-Bis（29：1）、1.3 ml/gel 分离胶缓冲液、0.05 ml/gel 10% APS、0.002 ml/gel TEMED 于 EP 管，使用震动仪混匀后放置通风橱。

　　3. 安装制胶架：将玻璃短板和长板置于制胶架，注意将两块板下层对齐，卡紧，移至通风橱用以注胶。

　　4. 注入分离胶：用胶头滴管吸取分离胶，小心注入，直至分离胶上缘至长板上缘2 cm左右处，顶层注入无水乙醇，等待30 min后凝胶，倒出无水乙醇。

　　5. 配置浓缩胶：制备 2 ml/gel的分离胶，用合适规格移液枪吸取 1.15 ml/gel DDW、0.33 ml/gel 30% Acr-Bis（29：1）、0.5 ml/gel 浓缩胶缓冲液、0.02 ml/gel 10% APS、0.002 ml/gel TEMED于EP管，使用震动仪混匀后放置通风橱。

　　6. 注入浓缩胶：用胶头滴管将浓缩胶注入预留好的 2 cm空隙，小心插入加样梳，注意不要残留气泡，等待 30 min凝胶。

　　（二） 上样与电泳

　　1. 将玻璃板从制胶架拿出，放入提前洗净的电泳槽内固定，垂直拔出梳子，在内槽加入足够电泳液，冲出加样孔内的气泡，根据所需上样量，使用相应的移液枪在上样孔加入样品及 marker。

　　2. 上样完毕后，在外侧电泳槽加入电泳液至相应刻度处（2 板或者4 板），盖上电泳槽的盖子（注意正负极）。

　　3. 打开电源，于 80 V电压下电泳，等待样品下缘齐平后调至 120 V，等待大约 90 min 溴酚蓝跑至即将出胶的位置。

　　（三） 转膜

　　1. 准备相应大小的一张 0.45 μm 或 0.22 μm PVDF膜（孔径根据目的蛋白分子量确定，低于 20 kDa 小分子可选择孔径小的膜）和四张滤纸，置于电转液中浸泡，PVDF 膜先于甲醇中活化。

　　2. 翘开玻璃板剥胶于电转液中，洗去残留的电泳液，后小心置于电转夹上，不能有气泡，电转夹板黑色板（负极）置于下部，按照“海绵-滤纸-胶-PVDF 膜-滤纸-海绵”的顺序安装好，每一步都要避免气泡。

　　3. 夹紧后放入电转槽中（电转槽预先放入加冰的塑料盆内），电转液加满并加冰块，295 mA 下转膜 1.5 h或 2 h（转膜时间依据目的蛋白分子量大小决定，大于 200 kDa 的蛋白可适当延长转膜时间）。

　　（四） 洗膜

　　电转完成后，将 PVDF 膜放进玻璃皿，用 TBST 溶液浸泡，放于摇床上 90 r/min*5 min，重复三次，洗去残留的电转液。

　　（五） 封闭

　　弃去 TBST 液，5% 脱脂牛奶浸泡 1 h，60 r/min。

　　（六） 抗体孵育

　　加一抗：将 PVDF 膜用 TBST 液浸洗三次，90 r/min* 5 min，根据目的蛋白及内参蛋白的分子量确定裁膜位置，装入抗体孵育袋，并加入适宜量的一抗溶液（2～3 ml为宜），小心封好，不要挤压 PVDF 膜，放入冰箱，4°C 过夜；

　　加二抗：

　　1. 过夜后取出，将抗体孵育袋放到摇床上恢复室温30 min，60 r/min，回收一抗。

　　2. 将 PVDF 膜取出（注意镊子夹在膜的边缘位置），用 TBST 液浸洗三次，每次5～10 min，90 r/min。

　　3. 将PVDF膜放入暗盒，加入带有荧光的二抗溶液，放置于摇床孵育 90 min，60 r/min。

　　4. 结束后用 TBST 液浸洗三次，每次5～10 min，90 r/min。

　　5. TBST液浸洗一次，5～10 min，90 r/min。

　　（七）红外扫膜仪显影

　　注意避光以及膜的整洁