免疫动物

　　（1）抗原：免疫动物是制备抗血清的第—步。免疫所用的抗原可用病毒、细菌或者其他蛋白质抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必须与大分子载体连接。抗原的用量视抗原种类及动物而异，—次注射小鼠可以少至几个微克，免、羊甚至更大的动物每次注射的量就相应增加，从几百μg/次至几mg/次。

　　〔2）佐剂及乳化：佐剂可以帮助抗原在注射部位缓慢释放，以增加免疫刺激的效果。佐剂有完全和不完全佐剂之分。完全佐剂加有灭活的分枝杆菌（如卡介苗）或棒状杆菌。福氏佐剂可从试剂公司购买，也可用羊毛脂和石蜡油按1：2—4混合自行制备。佐剂与抗原按1：1的比例混合乳化为均匀的乳液，放置后不会发生油水分离。

　　（3）免疫动物：常用于制备抗血清的动物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生产可用动物羊、马等，动物接受免疫的乳液量小鼠为1．0—2．0 mL，家兔为2—4mL。抗原免疫动物的途径取决于动物种类、抗原特性和是否使用佐剂。腹腔注射（i．p），肌肉注射（i．m），皮内注射（i．d．）和皮下注射(s．c．）适合于任何抗原，这些途径主要刺激局部淋巴结发生免疫应答，初次免疫和免疫加强注射均可使用。静脉注射（i.v.）则只适合于可溶性抗原及分散的单细胞悬液，且不能使用佐剂，其诱发的免疫应答主要发生在脾脏。此外，在单克隆抗体制备时，亦可用脾脏直接注射或体外免疫方法，尤其对微量抗原比较实用。体外免疫方法也常用于人源单克隆抗体的制备。体外免疫时将脾细胞或外周血淋巴细胞（包括B细胞，T细胞及抗原递呈细胞）与抗原一起作体外培养，然后再与骨髓瘤细胞融合。初次免疫后要经过2—3次以上的免疫加强以保证能形成较高水平的IgC抗体。两次免疫注射之间的时间间隔，一般3—4周比较适合大部分动物，小动物可间隔10—14d，大动物则在2月左右。在免疫加强最后一次注射后的一周内采集抗血清，可获得高水平的抗体。

抗血清的纯化与保存

　　（1）采血：加强免疫的动物2—3次后，可通过耳静脉或眼球（小鼠）采血，进行抗血清效价测定。当效价达到理想的高度后，可以采血。采血方式可以从心脏直接取血，也可通过动脉放血。待血液凝固后用针筒或吸管吸取血清。

　　（2）抗血清的纯化与保存：除抗体外血清中含有多种其他蛋白成分。为了避免这些蛋白质干扰抗体（免疫球蛋白）标记反应和抗原抗体反应，抗血清可经过纯化以获得单一的机体（常为IgG）组分。常用的纯化IgG的方法为饱和硫酸胺盐析和层析法。蛋白质在不同的盐浓度的溶液中，其溶解度不一样，盐离子干扰蛋白质和水分子间氢键形成，因为水—盐结合比水—蛋白质结合更稳定，蛋白质即可从溶液中沉淀出来。蛋白质分子越大，沉淀时所需盐离子浓度越低。免疫球蛋白（Mr 1.5×105）比血清中主要蛋白质白蛋白（M r 6.7×104）的分子大得多，抗体在30%—50%饱和度的硫酸盐中析出，而白蛋白需在70%—80%饱和度才析出，因此常用33%饱和度的硫酸胺纯化血清中的IgG。盐析时为了减少抗体变性，需在4℃进行，同时用pH8.0缓冲液稀释抗血清，以减少蛋白浓度过高而发生共沉淀。铵盐的溶解度不随温度变化而明显改变，0℃和25℃仅差3%，而钠盐则相差5倍，因此常在低温沉淀时用铵盐，室温沉淀用钠盐。铵盐对抗体的标记反应（如FITC和biotin标记时）有一定的干扰作用。

　　盐析法只能部分纯化抗体，更高纯度的抗体制剂可用层析法制备。IgM五聚体相对分子质量达9.7×10，比血清中任何其他蛋白都大，用分子筛层析很容易将其纯化。IgG在PH 8．0时带负电荷，能与DEAE纤维素上的阳离子结合，因此可用离子交换层析来纯化IgG。IgG纯化最常用的方法为亲和层析。IgG与葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白具合高度的亲和性，可用这两种蛋白质交联亲和层析柱将IgG纯化。大部分IgG与蛋白A结合PH为8—9，洗脱PH为2—4；而与蛋白G的结合PH为5—7，洗脱PH为9—10。C蛋白更适合于IgG的纯化，不但反应条件为温和的弱酸性或弱碱性，并且与IgG的结合力高于A蛋白。G蛋自能与大部分动物种类的IgG结合，而A蛋白对小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、马和绵羊IgG结合力弱或不能结合G蛋白和A蛋白均不能与鸡IgG结合。

　　抗血清或纯化的抗体在低温保存可维持活性数年，反复冻融使抗体很快失活，被细菌或霉菌污染的抗血清或IgG制品也易失去活性。稀释的抗血清加入防腐剂叠氮化钠和保护剂如BSA等可于4℃保存。长期保存常用等量甘油于—20℃以下冷藏。也可置于 50%饱和硫酸铵中4℃保存，还可以冷冻干燥保存。