1.什么是荧光定量PCR？

　　荧光定量PCR(Quantitative Real-timePCR，qPCR)是一种在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

　　2.荧光定量PCR的原理

　　qPCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。而qPCR的方法相应的可分为特异类和非特异类两类，特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物；而非特异性检测方法是在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。

　　（1）荧光探针法

　　Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。当探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；当PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光发射基团荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。目前常用的荧光基团有FAM, TET, VIC, HEX。

　　（2）荧光染料法

　　目前常用的荧光染料是SYBR Green I，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

　　3.qPCR的流程

　　4.qPCR的结果分析

　　在qPCR进程中，随着产物的积累，荧光信号的强度等比加强。每经过一次循环，收集一次荧光信号，即可得到一个荧光扩增曲线，根据荧光强度的变化即可监测产物量的变化。荧光扩增曲线可分为三个阶段，即荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此可以在该阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较，在指数期需要设定一个荧光信号的阈值。检测到的荧光信号超过阈值则被认为是真正的信号。荧光信号由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数称为Ct值。模板的Ct值与其起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，则Ct值越小利用已知起始拷贝数的标准品及其相应的Ct值可绘制出标准曲线，测得未知样品的Ct值后，根据标准曲线便可准确计算出该样品的起始拷贝数。

　　荧光定量 PCR 的扩增曲线（左）和模板量与 Ct 值的关系（右）

　　目前，qPCR技术已在生物医药食品等行业有广泛应用，比如疾病的早期诊断、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、基因扩增等。

　　（1）致病菌与食品安全环境卫生等方面息息相关，因此对于致病菌的检测是至关重要的。巴塞罗那自治大学的Jos´e Juan Rodríguez-Jerez教授团队通过实时荧光定量PCR检测干燥条件下粘附在不锈钢表面的鼠伤寒沙门氏菌和单核增生李斯特菌的能力，并与常规方法进行比较。相关文章以“Detection by real-time PCR and conventional culture of Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes adhered to stainless steel surfaces under dry conditions”发表于《Food Control》。

　　通过实时荧光定量PCR获得的Ct值和TSAYE中的活细胞计数之间观察到了高度相关性（R2=0.9718，p<0.0001）。鼠伤寒杆菌计数的增加而Ct值的下降，因为Ct值与样品中目标DNA的含量成反比。

　　（2）挖掘新的特异性分子靶点和建立有效的鉴定方法对物种鉴定具有重要意义。华南农业大学王涓副教授团队采用泛基因组分析选择了铜绿假单胞杆菌的4个新的靶基因，基于这些靶基因设计引物建立检测方法。该方法可用于致病性铜绿假单胞菌的快速筛选和检测，提供准确的结果，提供有效的监测措施，以提高微生物安全性。相关文章以“Pseudomonas aeruginosa Detection Using Conventional PCR and Quantitative Real-Time PCR Based on Species-Specific Novel Gene Targets Identified by Pangenome Analysis”发表于《Frontiers in Microbiology 》。

　　利用优化后的qPCR检测条件，通过绘制循环阈值（Ct）值与人工污染番茄纯培养中铜绿假单胞菌的对数数建立了人工污染样品中铜绿假单胞菌检测的标准曲线。这些方法的线性检测范围为1.33×102CFU/g~1.33×108CFU/g。4条标准曲线呈理想的线性相关，引物PA12的R2值为0.9944，引物PA13为0.9851，引物PA14为0.9814，引物PA13为0.9853。引物PA12和PA15的LOD值为1.33×104CFU/g，引物PA13和PA14的LOD值为1.33×103CFU/g。与终点PCR方法相比，qPCR方法的敏感性要高出一个数量。

　　（3）系统的SARS-CoV-2病毒检测是感染控制和监测的一个有价值的工具。德国科隆大学医学院的Florian Klein教授团队开发了一种用于儿童新型冠状病毒检测的高通量方法（“Lolli方法”），将非侵入性样本收集与RT-qPCR-pool检测策略相结合。该团队通过3个月的测试证明了Lolli法是SARS-CoV-2监测的有力工具，可以支持学校和日托设施的感染控制。相关文章以“Effective high-throughput RT-qPCR screening for SARS-CoV-2 infections in children”发表于《Nature Communications》

　　该团队为学校和日托所开发了一个筛选概念。研究人员在取样点收集一个组的样品，然后进行qPCR分析。简单来说一个班的每个孩子都收到一个拭子进行自我取样，并将其放入一个50 mL试管中。通过新型冠状病毒qPCR测试收集的样品。如果样本被检测为阴性，所有的孩子都被假定为新型冠状病毒阴性。在集合被检测为阳性的情况下，阳性集合的儿童被单独重新取样并进行qPCR检测，以鉴定被感染的个体。