体外培养的血管内皮细胞已广泛应用于血管疾病、血管修复、肿瘤血管形成等基础研究及临床研究中。体外培养的血管内皮细胞，仍可保持血管内皮细胞的特征，如表达VIII因子、怀布尔－帕拉德小体(Weibel-Palade body ) 、内皮细胞特异性抗原和IV 型胶原等，还可在三维培养体系或特定诱导条件下形成血管样结构。体外培养的血管内皮细胞生长形成单层后，会表现出接触抑制和密度限制，将停止生长。人们已成功培养了牛主动脉内皮、人脐静脉内皮、脑微血管、肺微血管、肝窦微血管及各种肿瘤组织中的血管内皮细胞。下面小编就来介绍下最常用的人脐静脉血管内皮细胞的培养。

　　一、材料与设备

　　1. 设备  超净工作台、离心机、水浴锅、CO2培养箱、－10℃ 冰箱、－20℃冰箱。

　　2. 无菌材料  大培养皿、止血钳、静脉插管、500ml 大烧杯、消毒的蒸馏水、50ml 离心管、刻度吸管、弯头吸管、T25 培养瓶、广口试剂瓶、脐带(1根）、保鲜液(0.01% EDTA/DMEM, 4℃储藏）、高糖DMEM 培养液、胎牛血清、青／链霉素、D-Hanks 溶液、I 型胶原酶、VEGF 或ECGS 。

　　二、操作流程

　　1. 产科无菌取脐带1 根， 置于含保鲜液的广口试剂瓶中4℃保存（避免污染），在最短的时间内，将脐带携入实验室，进行以下操作。

　　2. 在超净工作台或无菌层流工作台上，将脐带用D-Hank 溶液清洗干净，将静脉插管插入脐静脉中，并用丝线结扎、固定。

　　3. 用20ml 注射器将37℃ 的D-Hanks 溶液注入脐静脉，反复冲洗至清洗液无色澄清为止。

　　4. 用血管钳夹住脐静脉的另一端，并将0.2％的Ⅰ型或Ⅱ 型胶原酶（约20ml) 通过静脉插管注入脐静脉中， 至脐静脉完全充盈为止（排掉静脉管中的空气）。

　　5. 将脐带放置在盛有37℃水的玻璃烧杯中，在37°C 水浴条件下消化约20min（每5min 抽吸／注入1 次）。

　　6. 当酶液变成混浊时（在显微镜下可见大量游离细胞），将酶液在脐静脉中反复抽吸冲打3 次后，吸出并置于50ml 离心管中。

　　7. 细胞悬液经350g 离心5min 后，弃去上清液，并用D-Hanks 溶液清洗2次，然后再以350g 离心5min 。

　　8. 弃去上清液，将细胞溶于8ml 内皮细胞培养液(M l99 80ml、FBS 20ml 、PS 1ml 、L-Gln 2mM、ECGS 10mg/100ml 、Heparan 4000U/1 00ml 、Insulin mu/100ml)中，接种于预先包被2％明胶的T25 培养瓶中。

　　9. 细胞培养在37℃ 、5% CO2培养箱中， 24h 后换液，弃掉未贴壁细胞。之后每2~3d 换液1 次， 待细胞汇合时消化传代。

　　三、细胞鉴定

　　体外培养成功的细胞，需进行纯度鉴定。可提供检测其特性来鉴定，如表达Ⅷ 因子、Weibel-Palade 小体，摄取乙酰化低密度脂蛋白，表达内皮细胞特异性抗原CD31 等。

　　四、提 示

　　培养的脐静脉内皮细胞是使用最规范的体外血管内皮细胞模型。其培养已较成熟。但由于其传代有限，往往需不断重复培养。另外，培养脐静脉内皮细胞时，最好能添加VEGF 或ECGS, 以刺激血管内皮细胞增殖，可增加传代数，获得较多的血管内皮细胞用于研究。