大家做qRT-PCR检测时，可能会经常看到一些非常奇怪的扩增图，并感到一头雾水。下面小编为大家整理了qRT-PCR中常见的10个问题及其解决方法。 

一、如何判断qRT-PCR数据有效性

扩增曲线

应展现出一条平滑的S型扩增曲线，起始阶段无扩增现象，起峰时间符合顺利达到扩增平台期的正常标准。阳性结果的Ct值应调整在15到30之间，而阴性对照Ct值应大于35，内参基因的Ct值小于20，不同样品之间内参基因的Ct值差异不超过1个单位，对于复孔Ct值标准偏差在0.5以内。

溶解曲线

应呈现宽度较小的单峰，表明是特异性扩增 

标准曲线

斜率范围在-3.58至-3.10之间。引物扩增效率保持在90%至110%之间，这意味着引物的扩增能力相对稳定，并且效率较高。R2值通常用来表示数据点与回归线之间的拟合程度，当R2值大于0.98时，意味着实验数据的线性关系非常强。

二、扩增曲线不稳定

可能原因：

1. RNA纯度不足，未达到实验所需标准。

2. 体系中杂质含量过高，影响实验效果。

3. 仪器长时间使用，性能可能出现偏差。

解决方法：

1. 遵循实验流程，确保提取的RNA纯度达到实验要求。

2. 对体系中的杂质进行严格的控制和除去。

3. 定期对仪器进行校准和维护，确保仪器性能稳定。

三、扩增无法达到平台期

可能原因：模板丰度低；循环数过少；试剂扩增效率不佳。

解决方法：

1. 为确保实验准确性，建议适当提升模板的添加量，以增加模板浓度。

2. 适当增加循环次数，以确保充分扩增。

3. 通过标准曲线测定方法，适当调整镁离子浓度，并考虑更换为扩增效率更高的试剂。

四、曲线下降

可能原因：

1. 体系中存在降解现象；

2. 模板浓度超过了适宜范围，导致浓度过高。

解决方法：

1. 提高体系纯度，以减少降解的发生；

2. 适当减少模板量，使其达到合适的浓度范围；

3. 在确保实验准确性的前提下，适当降低荧光阈值，以优化实验结果。

五、单峰但不尖锐

可能原因：

1. 试剂成分的特异性可能影响实验结果。

2. 存在与目标序列大小相近的非特异性扩增产物。

解决方法：

1. 若实验过程中的温度跨度未超过7℃℃，则可将实验结果视为有效。

2. 建议进行高浓度琼脂糖电泳，以确认是否形成单一条带，进而验证实验结果的准确性。

六、单峰，Tm低于80℃

可能原因：

1. 存在引物二聚体。

2. 扩增的片段长度过短。

解决方法：

1. 首先确定实验过程中是否已正确加入模板，以确保实验条件符合预设要求。

2. 建议进行琼脂糖电泳检测，以验证扩增产物条带的大小是否符合预期。

七、双峰，较低峰Tm在80℃之前

可能原因：模板浓度不足或引物浓度偏高可能导致引物之间非特异性结合，进而形成引物二聚体。 

解决方法：

1. 适当提高退火温度，以减少非特异性结合发生。

2. 增加模板的投入量，降低引物浓度，优化反应体系。

3. 重新设计引物。

八、双峰，Tm都在80℃之后

可能原因：

1. 引物特异性不好。

2. 空气中存在气溶胶污染。

解决方法：

1. 利用BLAST工具进行引物特异性检查，并根据检查结果重新设计引物。

2. 在严格的超净工作台中操作，采用专用的移液器分别加入引物，确保操作遵循无菌操作规范，减少交叉污染的风险。

九、其它非正常熔解曲线

可能原因：

1. 体系受到污染，或试剂失去有效性。

2. 耗材与仪器之间不兼容，或检测通道选择不当。

3. 仪器长时间未进行必要的校准操作。

解决方法：

1. 在超净台内配制体系，避免污染。

2. 避免将试剂暴露于强光或高温环境中，以维持其稳定性，注意试剂限用时间，避免过期。

3. 执行阳性、阴性对照，选择与仪器完全匹配的耗材。

4. 定期仪器进行校准，确保其准确性和稳定性。

十、标准曲线线性关系不佳

可能原因：

1. 加样误差：加样过程中的操作误差使样本量不准确。

2. 标准品降解：标准品在存储或使用过程中发生降解。

3. 模板浓度高或有抑制物：模板的浓度过高或含有抑制PCR反应的成分，可能导致实验结果不准确。

4. 引物或探针不佳：引物或探针的设计不合理或质量不佳，可能无法有效进行PCR扩增或检测。

5. PCR酶的灵敏度可能因存储不当或过期而下降。

解决方法：

1. 严格控制标准品的加样体积，确保大于2ul。引物在使用前进行预混再分复孔使用。定期校正移液器，以减少误差。选择硅化枪头，以降低管壁对DNA的吸附。

2. 避免反复冻融，以减少降解。

3. 调整稀释精度，增加稀释梯度，以优化模板的浓度。

4. 重新设计引物和探针，确保其特异性。

更换灵敏度更高、线性关系更好的PCR试剂。同时：对-20℃冰箱进行校正，确保试剂的存储条件适宜。在使用酶时，应将其置于冰上，以保持其活性。