免疫荧光是实验室常用的技术之一。但在操作过程中，有许多需要注意的细节，任何一个环节的失误都可能导致实验失败。那如何才能顺利得到漂亮的免疫荧光图呢？今天给大家带来超全的免疫荧光步骤，并附上实验注意事项！

一、基本原理

细胞免疫荧光将细胞进行爬片、因定、透化、封闭后，加入一抗与抗原蛋白结合，再加入标记有荧光素的二抗与一抗进行反应，最后通过激光共聚焦扫描显微镜进行荧光拍摄，来显示细胞中靶蛋白的表达变化和定位。

直接法：目的蛋白和带有荧光基团的一抗结合。

间接法：目的蛋白和一抗结合，然后一抗再与带有荧光基团是二抗结合，通过荧光显微镜可观测到荧光，进而观测到目的蛋白。

二、步骤流程

01 DAY1

①将爬片用清洁剂清洗干净，用自来水将清洁剂冲干净，再用纯水冲洗，泡在75%的酒精中静置10min，然后在酒精灯上将酒精烧干，温度不可太高，后放入孔板中；（由于懒惰和贫穷，可以直接喷酒精后纱布擦干，过酒精灯烧一下，不要烧太久，易碎哦~孔板用6、12或24孔板皆可！）

②将细胞悬液（约1-2x10~4个细胞）滴加在爬片上（体系视自己情况而定），置37℃、5%C02培养箱中培养过夜，细胞密度以达到75%~85%最佳。

02 DAY2

①将已爬号的细胞的玻片用PBS洗3次，每次3~5min；

②固定：用4%的多聚甲醛室温固定爬片15min~30min（体系视孔板底面积而定），PBS浸洗玻片3次，每次3~5min；

③透化：0.5%TritonX-100（PBS配制）室温透化5~20min（抗原细胞膜上表达的省略此步骤）；

④封闭：PBS漫洗玻片3次，每次3-5min。吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清或2%BSA，空温封闭30min；

⑤孵一抗：吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量且稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。

03 DAY3（避光处理）

①加荧光二抗：PBS漫洗爬片3次，每次3-5min，吸水纸吸干爬片上多余液体后，滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中室温孵育1h，PBS洗3次，每次3~5min；

②复染核：滴加DAPI避光孵育5min，PBS洗5min，洗4次；

③用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

三、注意事项

1．细胞密度太大，会造成拥挤而边界不清晰，细胞形态不佳且易导致染色背景深；细胞过少时不宜贴壁，易发生非特异性荧光染色。

2．3.7%~4%的甲醛或多聚甲醛是最常用的固定剂，适用于绝大多数蛋白，膜蛋白最好用3.7%~4%的甲醛，细胞骨架成分可用甲醛固定。

3．通透即是在膜上打孔，让抗体更易进入细胞与抗原结合。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质，一般可以用0.1%~0.2%的TritonX100。而如果选择甲醇固定一般无需再通透，甲醇本身就有通透作用。

4．若细胞粘附性不强，则爬片时用多聚赖氨酸进行预处理，增加细胞粘附性（用多聚赖氨酸涂在爬片上放置30~120min，然后用灭菌的超纯水清洗和浸泡，自然干燥后放在紫外下照射至少1h以上）。

5．一抗二抗具体的稀释倍数需要参考不同抗体的说明书。

6．一抗可以选择4度过夜孵育或者室温3h（4度过夜孵育比较好，抗原抗体结合更充分）；如果抗体浓度过低，会造成信号太弱，如果抗体浓度过高，可能会造成背景染色太强。

7．洗涤步骤，PBS即可。在洗涤过程中，一要注意动作轻柔，固定后的细胞比较脆弱，细胞易被吹洗掉；二是不要干片，即洗掉溶液后不要把细胞干着，不然容易造成背景着色。

8．在爬片放入前可先加少量培养基在孔板里，然后把爬片贴上去，这样可以贴的很牢固也没有气泡。

9．取爬片时，由于爬片与培养皿底结合较紧，可将注射器针尖向背面做个小钩，将爬片轻轻勾起，用小镊子取出即可。

10．拍照时要选择合适的激发光源。PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。

11．4%甲醛、0.2%Triton、2%BSA，均用IxPBS稀释。

12．染完之后没有封片之前照一次相，因为有的时候可能封片会出问题，无法再照出想要的结果，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭。