今天我们要学习的内容是：NK细胞的基础概念及其研究思路。众所周知，NK细胞不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质！它对于我们人体来说，是一个不可或缺的功臣！

一、相关概念
NK细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，是广泛分布的细胞毒性淋巴细胞，在先天免疫系统中起着核心作用。且它随着血液系统在全身不断循环，发挥免疫监视的功能，无需抗原预先致敏就能杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞和其他生理应激细胞（如衰老细胞）等。它具有无主要组织相容性复合体（MHC）限制性和应答速度快两个主要特点。

NK细胞表达两类受体：一类是抑制NK细胞杀伤作用的受体，称为NK细胞表面抑制性受体，包括Tim-3、NKG2A、LAG-3、TIGIT等；另外一类是激发NK细胞杀伤作用的受体，称为NK细胞激活性受体，也就是活化性受体，包括NKp46、NKG2D、NKP30等。

1.那么NK细胞是如何对靶细胞进行识别并杀伤的呢？

首先进行“身份核验”：我们都知道，正常细胞表面都会展示MHC-I分子，以防止免疫系统攻击。然而，癌细胞有时会偷偷摸摸地减少或丢失MHC-I的表达，试图躲过免疫监测。不过，机智的NK细胞可不会被蒙蔽，它们正是通过识别缺乏MHC-I的细胞，锁定并攻击癌细胞。

第二步开启“一键激活”模式：当NK细胞的表面受体与目标细胞接触时，活化性受体可能会被激活，而抑制性受体则可能被抑制。例如：当病毒感染细胞和肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子表达减少、缺失，或由于MHCⅠ类分子结构发生异常时，NK细胞的抑制性受体不能识别相应配体，激活性受体占主导作用使NK细胞活化并发挥杀伤活性，导致病毒感染细胞和肿瘤细胞坏死或凋亡。

2.被激活后的NK细胞则主要通过以下几条途径杀伤靶细胞：

①　释放活性介质。比如：穿孔素和颗粒酶，当穿孔素在靶细胞上形成“孔洞”后，可致靶细胞坏死；同时，颗粒酶可进入靶细胞，通过激活内源性核酸内切酶系统，使靶细胞DNA断裂而导致细胞凋亡。

②　死亡受体/配体相互作用。NK细胞通常表达3种死亡配体：Fas配体（FasL）、TNF配体和TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL），这些配体通过与肿瘤细胞表面相应死亡受体结合引起细胞凋亡。

③　抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）。NK细胞表达的CD16与靶细胞的IgG Fc段结合，通过信号传导使其活化，进而对靶细胞选择性攻击，发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）。

④　分泌一系列的细胞因子和趋化因子。NK细胞能分泌干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）等多种细胞因子。其中，IFN-γ能抑制肿瘤细胞增殖，阻断肿瘤血管形成以及上调细胞MHC分子表达来刺激抗原提呈；TNF-α活化靶细胞核酸内切酶，降解DNA，引起程序性细胞死亡；IL-2刺激NK细胞增殖，增强其杀伤活性。

二、案例分析
在了解NK细胞的相关知识点后，我们来阅读一篇关于NK细胞的高分文献吧。

这是一篇影响因子为13.6的文章，名为“放疗通过CXCL8协调自然杀伤细胞依赖的抗肿瘤免疫反应”。

研究背景

当前，放射治疗是一种主要的癌症治疗方法，可以单独使用或与化疗药物联合使用。肿瘤细胞在高剂量辐射暴露后进入细胞衰老状态，伴随着可溶性介质的释放。在这些介质中，细胞因子白细胞介素-6和白细胞介素-8（CXCL8）可以诱导肿瘤的侵袭和转移，与各种肿瘤类型的癌症患者不良的总生存率有关。而NK细胞正通过过继转移等方式被用于癌症治疗，此外，更常见的方式是将NK细胞与治疗性抗体（如西妥昔单抗）结合，通过之前提到的Fc受体CD16介导ADCC的途径来实现对肿瘤细胞的杀伤。但目前NK细胞难以浸润实体瘤的事实，成为了阻碍了其发挥抗肿瘤活性的原因。因此，文章作者假设，当治疗性抗体与高剂量辐射结合时，可能有助于NK细胞对肿瘤细胞的结合，并对此展开研究。

接下来就和我一起探寻作者的整个研究过程吧~

现有研究已经证明，在胰腺癌、卵巢癌等实体瘤中，衰老相关的CXCL8能够通过CXCL8/IL-8依赖机制，诱导NK细胞等先天免疫监视细胞在放疗下进行增殖和定向浸润。

Fig 1放化疗联合治疗（RCTX）调节胰腺癌患者CXCL8浓度和NK细胞数量

为了探究放化疗联合治疗对胰腺癌患者CXCL8浓度和NK细胞数量的影响，作者在一项随机对照临床试验中，分别对接受RCTX后联合吉西他滨和西妥昔单抗维持治疗（B组）以及吉西他滨单独治疗（A组）的胰腺癌患者进行了白细胞和细胞因子水平测定。血清细胞因子分析结果显示：只有CXCL8浓度在RCTX期间显著升高，并且全血基因表达数据的白细胞亚群去卷积显示：RCTX期间外周血中静息NK细胞数量有一过性下降；之后作者这些患者的生存时间进行了生存分析，结果显示：治疗前CXCL8血清水平与中位总生存期（mOS）之间无显著负相关性；而在西妥昔单抗维持治疗中，血清CXCL8水平高于中位值（29.8pg/ml）的患者mOS更高；我们还可以看出治疗前高于中位的NK细胞数量与mOS延长有很强的预后相关性；在B组治疗中，外周血NK细胞下降中位数以上的患者mOS延长。

由此我们可以得出结论：在接受西妥昔单抗治疗的放疗胰腺癌患者中，CXCL8水平的升高和NK细胞的外流均与生存相关。且放化疗联合治疗（RCTX）可调节胰腺癌患者CXCL8浓度和NK细胞数量。

Fig 2胰腺癌浸润的NK细胞表现出CD56dim样细胞毒性转录组状态

接着作者评估了胰腺癌患者的NK细胞丰度和表型。在对照射（RT）和未照射（non-RT）患者肿瘤组织进行NKp46免疫组化染色后，作者发现与对照患者相比，经RCTX治疗的病人肿瘤中优先聚集NK细胞，随后作者在使用公共单细胞RNA测序数据评估pdac浸润NK细胞的转录组状态，并分析胰腺癌浸润NK细胞的表型和趋化因子受体表达模式后，发现在未受照射的胰腺癌和正常胰腺组织中，NK细胞中Fc受体（FCGR3A）高表达，标志NK细胞的CD56dim样表型，可能是NK细胞对西妥昔单抗等治疗性抗体产生反应的原因；此外，差异基因表达谱和随后的基因集富集分析结果显示，在所有白细胞中，NK细胞表达最高水平的细胞毒性介质；GZMB、PRF1、FGFBP2和FGFBP2是CD56dim样肿瘤浸润NK细胞中上调最多的基因。

由此我们可以得出：胰腺癌浸润的NK细胞表现出CD56dim样细胞毒性转录组状态。

Fig 3辐射触发CXCL8释放和NK细胞向受辐射肿瘤迁移

接下来，作者围绕辐射对CXCL8释放和NK细胞的影响展开了研究。在对每个细胞系分别进行2-4次独立实验辐照后，作者发现辐射仅显著诱导CXCL8表达，且在3个胰腺癌细胞系和前列腺癌细胞株（PC-3M）中，辐射诱导的CXCL8释放在二维单层和三维球体系统中均呈时间和辐射剂量依赖性，同时辐射也上调了CXCL8的转录表达。接着作者进行了体内实验，即对小鼠静脉注射转染荧光素酶的SK-Mel-28黑素瘤细胞，并进行20gy肺场照射/假照射，作者发现受照射的异种移植小鼠中显示更多的CXCL8阳性转移和转录表达；肿瘤照射后，静脉注射激活的NK细胞过夜，发现外周血中的NK细胞数量下降，并且在受照射的肿瘤中累积，这表明辐射诱导的NK细胞从外周

血进入肿瘤组织。

由此我们可以得出结论：辐射可以触发CXCL8释放和NK细胞向受辐射肿瘤迁移。

Fig 4辐射诱导肿瘤细胞衰老特征和NF-κB通路激活

为了进一步验证辐射对肿瘤细胞的影响，作者对肿瘤细胞进行处理后照射，发现辐射显著增加了衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性肿瘤细胞的比例，且呈辐射剂量依赖性；在照射的第四天，作者发现辐射可诱导肿瘤细胞中p21的表达，使用免疫印迹法（WB）检测p65在亚细胞部分在SK-Mel-28细胞部分的表达，结果显示：核内p65的表达在肿瘤细胞照射后增加。

由此我们可以得知：辐射诱导肿瘤细胞衰老特征和NF-κB通路激活。

Fig 5NF-κB和mTOR参与了辐射诱导的CXCL8释放

为了探究辐射诱导CXCL8释放过程中的影响因素，作者进行了进一步实验。通过两天的40Gy照射，作者发现siRNA和基于CRISPR-Cas9的p65干扰均减弱了辐射对CXCL8的诱导作用。p65敲除pc-01球形体辐照的7天后，作者分别使用NF-kB抑制剂TPCA-1（如图C所示）和雷帕霉素（如图D所示）处理SK-Mel-28细胞条件培养基，发现NF-κB抑制剂TPCA-1抑制了辐射诱导的肿瘤细胞CXCL8释放，且雷帕霉素减少受辐射肿瘤细胞CXCL8的释放，抑制p70-S6激酶磷酸化，证实了其对mTOR的抑制作用，并增加了辐射中iκB-α水平，这说明它对NF-κB也有抑制作用。

由此我们可以得知：NF-κB和mTOR参与了辐射诱导的CXCL8释放。

Fig 6NF-κB依赖的CXCL8释放介导了NK细胞向辐射肿瘤细胞的迁移

下面，我们继续来看PPT中的AB两张图，A图是新分离的原代人NK细胞表面趋化因子受体表达的点图，B图是新分离的原代人NK细胞表面的趋化因子受体表达（填充）或各自同型对照染色（阴影）的代表性直方图，通过这两张图，我们可以得知：CD56dim而不是CD56bright型人原代NK细胞表达CXCL8受体CXCR1和CXCR2；之后作者进行了不同的实验处理，用重组CXCL8体外处理激活的NK细胞，如图C所示，结果显示重组CXCL8在体外能吸引CD56dimNK细胞；再收集40Gy照射5天后不同肿瘤细胞系的培养基，如图D所示，得出辐射诱导NK细胞向3种肿瘤细胞系迁移，提示可溶性介质可调控辐射诱导的NK细胞迁移；图E则是收集CXCL8中和抗体处理或不处理的40gy照射的SK-Mel-28细胞条件生长培养基；发现CXCL8中和抗体降低了NK细胞向受辐射肿瘤细胞的迁移；图F表示收集40Gy照射（RT）或模拟照射（非RT）的p65wt/wt或p65−/−PANC-01球体。得出：基于CRISPR-Cas9的NF-κB p65敲除抑制了CD56dimNK细胞向肿瘤细胞球的迁移。

由此，我们可以得出：NF-κB依赖的CXCL8释放介导了NK细胞向辐射肿瘤细胞的迁移。

Fig 7联合照射和过继性NK细胞转移抑制小鼠肿瘤生长

最后，作者通过NK细胞过继转移和放疗的异种移植小鼠模型来测试联合NK细胞和辐射在肿瘤治疗中的作用。作者将PBS中的NK细胞分别与经10Gy照射和未照射的荧光素酶转导的肿瘤细胞SK-Mel-28静脉注射到NK细胞缺陷的NSG小鼠体内，如图A所示。接着作者在指定时间点测定肺内肿瘤负荷，结果显示单独放疗或NK细胞治疗可获得较强的肿瘤控制效果，且联合放疗和过继性NK细胞治疗可进一步降低所有动物的肿瘤负荷，随后作者又在NSG小鼠中过继性转移NK细胞和PANC-01细胞，发现虽然NK细胞和辐射可以降低肿瘤负荷，但是只有联合NK细胞和辐射才能实现持续的PANC-01肿瘤控制。

由此我们得知：联合照射和过继性NK细胞转移抑制小鼠肿瘤生长。

结论

作者将CXCL8诱导的固有免疫监视的机制与人类放疗抗肿瘤反应联系起来，表明放疗可能是一种增强NK细胞浸润的治疗策略，易应用于临床，尤其适用于治疗前NK细胞数量较高的患者。由此，可以得出如果结合NK细胞的疗法，如治疗性抗体或过继性NK细胞转移，就可进一步提高接受放射治疗的癌症患者的NK细胞抗肿瘤活性。
最后我们再来回顾一下作者的整个研究思路：作者首先在随机对照临床试验中研究了胰腺癌患者在RCTX联合ADCC介导的抗体西妥昔单抗治疗后的NK细胞反应，再利用实验系统探索原代人NK细胞向实体瘤迁移的机制，最后在异种移植小鼠中测试了联合过继NK细胞和化疗的治疗策略。

三、研究思路

读完这篇文章，大家对基于NK细胞抗肿瘤活性的课题思路有想法了吗？我们也给大家总结了比较常见的研究思路，主要可以分为以下四个步骤。

首先确定研究肿瘤类型；

然后检索文献明确已研究的NK细胞在目标肿瘤微环境中的作用及机制；

再基于感兴趣的分子机制探究某种药物或治疗策略是否可以增强NK细胞抗肿瘤活性；

最后基于研究目的及科学假设，设计课题实验方案，包括临床、体内、体外等等。