众所周知，骨是人体重要的器官，承载着支撑运动，保护脏器等功能。在创伤、感染、肿瘤切除或先天性疾病等情况下，骨组织可能会产生缺损。骨缺损经常伴有软组织的损伤，包括肌肉、肌腱和关节损伤。骨组织具有自然愈合能力，但其再生过程复杂，受多种生理途径调控，涉及多种细胞和分子的参与。当骨缺损超出其自然愈合能力时，则需要临床干预。那么关于骨再生具体有什么样的研究思路呢？

下面，我们将分享一篇发表于中科院1区期刊Journal of Nanobiotechnology，影响因子为10.6的高分文献，名为《富含Bmp2 mRNA的外泌体水凝胶增强骨再生》，希望能给大家带来不一样的灵感。

【文章题目】：富含Bmp2 mRNA的外泌体水凝胶增强骨再生

【发表期刊】：Journal of Nanobiotechnology

【影响因子】：IF=10.6

【发表日期】：2023.04

一、研究背景

①转基因细胞在骨缺损区域合成BMP2，促进骨愈合。

②mRNA的基因治疗在治疗骨缺损方面比DNA的经典基因治疗有着更多优势。

③外泌体因其理想的天然结构和特性越来越多地被用作诊断和治疗疾病。

④富含BMP2的外泌体可以促进骨愈合。

⑤水凝胶可以作为外泌体的递送系统和支架实现外泌物的持续释放。

二、技术路线

三、研究结果

1.富含Bmp2 mRNA的工程外泌体的特性

为了构建富含Bmp2 mRNA的工程外泌体，如图1A所示，作者将两种人工质粒（Bmp2和NoBody）共转染到293T细胞中。图1B~C的qPCR和WB分析证实供体细胞表达NoBody蛋白，转染NoBody质粒抑制了供体细胞中BMP2蛋白的表达，轻微抑制了BMP2 mRNA的表达。

然后我们可以从图1D看到，作者将无外泌体FBS培养基中培养出的工程外泌体命名为Exo^BMP2+NoBody。从未转染的质粒或用单个人工质粒转染的细胞中获得的外泌体用作对照，分别命名为ExoNone、Exo^BMP2+Empty和Exo^NoBody+Empty。图1E~F的纳米粒子追踪分析和透射电子显微镜图像进一步证实，分离的细胞外囊泡符合外泌体的大小和形态。图1H的WB分析显示，实验组和对照组分离的细胞外囊泡都具有外泌体特性。

接着，我们可以从图1G的实验结果观察到，在293T细胞的外泌体中，Exo^BMP2+NoBody中Bmp2 mRNA的表达比空白组高8倍，比Exo^BMP2+Empty组高约3倍。如图1I所示，293T细胞与Exo^BMP2+NoBody共培养的结果表明，293T细胞内化了富含Bmp2 mRNA的外泌体，并高度表达Bmp2蛋白。这表明，与Bmp2 mRNA相互作用的NoBody蛋白在通过外泌体途径进入受体细胞后，对Bmp2 mRNA的翻译没有抑制作用。

2.BMP2+Nobody外泌体增强了骨生成
然后，为了研究工程外泌体是否可以在体外促进干细胞的成骨作用，作者从大鼠股骨和胫骨中提取大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs），如图2A所示，并与工程外泌体共培养。图2B的共聚焦成像显示，所有外泌体都有效转移到了靶细胞。共培养3天后，通过图2C的RT-qPCR检测发现，与Exo^BMP2+Empty、Exo^NoBody+Empty或对照外泌体处理的细胞相比，Exo^BMP2+NoBody处理的细胞中ALP、OPN和COL1a等主要成骨基因的表达显著增加。共培养7天后，如图2D所示，Exo^BMP2+NoBody处理的细胞中OPN和COL1a等相关成骨蛋白的表达显著增加。

此外，如图2E~H的ALP染色和茜素红染色结果所示，Exo^BMP2+NoBody刺激的成骨分化增加，ALP表达和矿化水平增加，最终说明BMP2+Nobody外泌体可促进骨生成。

3.GM-90-CP05+Exo水凝胶的特性

从图3A可见，作者通过将多肽片段CP05或烯丙基-L-甘氨酸（allyl-L-glycine-CP05）和外泌体溶解在不同氨基取代度的甲基丙烯酰化明胶（GelMA）溶液（GM60和GM90）中制备了改性水凝胶溶液。图3B实验结果显示，GM-90-CP05和GM-60-CP05组的外泌体比其他组更富集，外泌体与水凝胶之间的结合模式不仅包括简单的粘附和包封，还包括修饰CP05介导的共价结合。

为了检测水凝胶的降解，作者又将每组10%的水凝胶浸入PBS中，每10小时测量一次剩余质量。我们可以从图3C中发现GM-60-CP05+Exo水凝胶的降解速率最快，GM-90-CP05+Exo水凝胶降解速率最慢。

接着，为了检测水凝胶的外泌体释放，作者将DiI标记的外泌体以500µg/mL的浓度混合到水凝胶溶液中，每隔10小时检测一次水凝胶的外泌体释放。图4A就是改性水凝胶的外泌体缓释示意图。图4B~C的共聚焦激光图像和CD63-ELISA显示，GM90-CP05+Exo组中的外泌体释放时间最长，GM60+Exo组中的外泌体释放速度最快。综上所述，GM-90-CP05水凝胶可以延长外泌体的释放时间，因此选择GM-90-CP05作为工程外泌体递送载体。

4.GM-90-CP05水凝胶包裹BMP2+NoBody外泌体增强体外成骨作用

然后，作者将BMSCs接种在不同类型的水凝胶上，培养1天和3天进行活细胞和死细胞染色，如图5A所示，各组水凝胶的生物相容性和细胞增殖没有显著差异。培养2天后，图5B的共聚焦图像显示DiI标记的外泌体可以从不同类型的水凝胶中释放出来，并被BMSCs吸收。

接着，我们可以看到图6A~D中，与对照组相比，接种在含有Exo^BMP2+NoBody的GM-90-CP05水凝胶上的BMSCs表现出骨生成增加、ALP表达和矿化水平升高。这证实了GM-90-CP05水凝胶可以长时间保持BMP2+NoBody外泌体的成骨活性。

5.体内GM-90-CP05水凝胶递送BMP2+NoBody外泌体促进颅骨愈合

最后作者还研究了BMP2+NoBody外泌体在大鼠颅骨缺损模型中促进骨再生的效率。图7A是操作细节展示，先将Exo^BMP2+NoBody装载到GM-90-CP05水凝胶中，然后注射到SD大鼠的颅骨缺损处。图7B显示，7天后，GM-90-CP05+Exo^BMP2+NoBody中ALP、OPN和COL1a等主要成骨基因的表达显著增加。图7C~D的Micro-CT分析显示，与其余五组相比，GM-90-CP05+Exo^BMP2+NoBody植入物显著促进了骨愈合；在第8周，GM-90+Exo^BMP2+NoBody和GM-90-CP05+Exo^BMP2+NoBody之间的骨修复率差距进一步扩大；另外，新骨面积、骨体积/组织体积（BV/TV）和小梁数量（TB.N）的测量结果也表明了类似的趋势，其中GM-90-CP05+Exo^BMP2+NoBody组的值最大。

最后，图8的组织染色和免疫组织化学分析也证实了GM-90-CP05+Exo^BMP2+NoBody治疗组的实质性骨愈合，以上结果表明GM-90-CP05+Exo^BMP2+NoBody具有最好的持续骨修复能力。

四、研究小结

研究者通过选择性抑制供体细胞的翻译，将Bmp2 mRNA富集到外泌体中，在供体细胞中共同转染NoBody和改良的工程BMP2质粒。得到的外泌体被命名为Exo^BMP2+NoBody。然后通过体外实验证实，Exo^BMP2+NoBody具有更高的Bmp2 mRNA丰度，因此具有更强的成骨诱导能力。而当外泌体通过allyl-L-glycine-CP05载入GelMA水凝胶时，外泌体可以缓慢释放，从而确保了外泌体对骨的长期作用。最终在体内颅骨缺损模型中，发现Exo^BMP2+NoBody-loaded GelMA在促进骨再生方面表现出很强的能力。综上所述，Exo^BMP2+NoBody-loaded GelMA可以为骨再生提供一种高效和创新的策略。

五、国自然中标情况