做实验前，如果不理解每个步骤以及每个溶液的原理是啥，只会埋头咔咔做实验，真的挺吃亏的，有时候实验失败都不知道错哪里了.....

了解原理！掌握原理！运用原理！今天给大家整理了碱裂解法提取质粒过程中所使用溶液的作用原理！往后管它小提中提大提，统统拿下~

一、溶液1（P1）

1．主要成分：25mMTris-HCl（pH8.0）、10mMEDTA、50mM葡糖糖（Glucose），溶液1也可以不含葡萄糖。

2．主要作用：P1的主要作用是将菌体沉淀悬浮起来。

（1）Tris-HCl是缓冲溶液，确保反应体系的pH恒定

（2）EDTA是金属离子螯合剂，作用是与微生物体内的金属离子相互结合，抑制DNase的活性。

（3）葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，使菌体悬浮，延缓菌体沉降的时间。

注：P1在使用前通常要加入RNA酶（RNaseA），RNA酶的作用是降解掉溶液中的RNA。由于RNA酶属于蛋白质，蛋白质稳定性很差，所以加了RNase A的P1需要低温4℃保存。

二、溶液2（P2）

1．主要成分：250mM NaOH、1%（W/V）SDS（二烷基硫酸钠）。

2．主要作用：P2的主要作用是对细胞进行裂解。

（1）氢氧化钠的作用是破坏细胞膜的结构，使之从bilayer（双层膜）结构转变为micelle（微囊）结构，从而导致细胞的裂解。

（2）SDS的作用是与蛋白质分子结合，平均两个氨基酸就会结合一个SDS分子，从而形成SDS2多肽复合体，这样变性蛋白质将溶解在溶液中，并使得多肽链更好地与基因组DNA缠绕。这一步的目的是为下一步做铺垫。

注：添加P2后需要注意的一个是时间一定不能过长，另一个是不可以剧烈震动离心管。时间过长以及剧烈震动都将导致氢氧化钠破坏基因组DNA，断裂的基因组DNA碎片将会与大小相似的质粒一同被抽提，从而污染样品。

三、溶液3（P3）

1．主要成分：3M醋酸钾（potassium acetate）、5M醋酸。

2．主要作用：P3的主要作用是中和第二步加入的强碱以及清除蛋白质等细胞内的杂质。

（1）醋酸的作用是中和溶液。强碱溶液氢氧化钠长时间与DNA接触会破坏其结构，因此需要进行中和。

（2）醋酸钾的作用是清除蛋白质等杂质。在加入P3后，会有大量沉淀出现。这些沉淀是醋酸钾的钾离子与P2中的SDS2多肽复合物相互作用，反应生成不溶于水的十二烷基硫酸钾（PDS）。PDS的沉淀将变性的蛋白质一起沉淀了，同时变性的蛋白质与基因组DNA缠绕，因此大部分基因组DNA也被共沉淀了。而高离子浓度的溶液又加速了这一沉淀过程。此外，溶液被中和后，变性蛋白质表面电荷减少，也可以促进变性蛋白质沉淀。

四、Wash buffer（PE）

1．主要成分：10mM Tris-HCI（pH7.5）、80%乙醇（Ethanol）。

2．主要作用：清除多余的盐离子。实验中大家都是利用硅胶柱进行DNA提取的。在DNA与硅胶柱吸附后，需要利用PE清洗掉多余的盐离子。PE中含有高浓度的乙醇，由于乙醇会影响后续的酶切或测序反应，在洗脱DNA前必须要在离心机内“空甩”柱子，以除掉乙醇。

五、Elution buffer（EB、TE）

1．主要成分：10mMTris-HCI（pH7.5）或者ddH₂O。

2．主要作用：洗脱硅胶柱上的DNA样品。EB缓冲液中不能含有过高浓度的盐离子，因为在高盐环境中，盐阳离子会打破硅胶负氧根和水之间的氢键，使得整体的硅胶携带正电，会吸引携带负电的DNA分子。另外，加热过的洗脱液（<50℃）可以加速DNA从硅胶膜上脱离下来。另外，离心前保持EB缓冲液在膜上停留时间长一些，将更有利于DNA的洗脱。ddH₂O的洗脱效率较低，可以在第一次洗脱后，将洗脱液重新加到硅胶柱上进行第二次洗脱。