“干细胞”新玩法！重庆医科大学柳满然团队发现乳腺癌治疗的有效靶点！成功斩获中科院1区14.3分→
2025-02-05 11:30:00
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干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，医学界也称其为“万用细胞”。那么关于干细胞有什么课题设计思路呢？今天我们一起来探讨一下。
今天我们将分享一篇发表于中科院1区期刊ADVANCED SCIENCE，影响因子为14.3的高分文献，名为《一种新长链非编码RNA通过稳定SQLE mRNA和增加胆固醇合成来维持乳腺癌干细胞干性》，希望能给大家带来不一样的灵感。
【文章题目】：一种新长链非编码RNA通过稳定SQLE mRNA和增加胆固醇合成来维持乳腺癌干细胞
【发表期刊】：ADVANCED SCIENCE
【影响因子】：14.3
①CD44+CD24-和ALDH+是乳腺癌肿瘤干细胞（BCSCs）最常见的标记物。乙醛脱氢酶（ALDH酶）水平或活性的增加表明癌细胞具有高的致瘤潜能和癌症干细胞（CSC）特性。
②血液、细胞内的胆固醇水平与肿瘤发病、死亡、生长、迁移和侵袭相关。
③在前期工作中发现在乳腺癌和乳腺癌干细胞中存在胆固醇合成异常。
④长链非编码RNA（lncRNAs）在多种生物过程和疾病中发挥重要作用。
二、技术路线
三、研究结果
1、lnc030在BCSCs中高表达
既往研究表明，上皮-间充质转化（EMT）可使癌细胞具有干细胞样表型。为了研究失调的lncRNA是否参与BCSC的形成，在图1A中，他们通过lncRNA/mRNA微阵列分析鉴定出MCF-7和MCF-7/BCSC细胞间的一组失调lncRNA。经过生物信息学分析，选择上调的新型lnc030作为进一步研究对象，因为它与胆固醇代谢有功能关联。图1B显示，lnc030在乳腺微球中高表达。在图1C~D中，使用TCGA数据库发现lnc030在大多数乳腺肿瘤组织表达增加且与乳腺癌患者预后较差相关。此外，图1E~G显示，与乳腺癌患者中分离的附着原代细胞相比，lnc030在乳腺癌球体中的表达显著增加；通过RNA-fish和细胞分离分析，发现lnc030主要定位于Hs578T、BT549和MCF-7乳腺癌细胞的细胞质中。且从图1H可看出，与lnc030低水平的乳腺癌组织相比，lnc030高水平的乳腺癌组织中CD44的表达更高，CD24的表达更低。综上所述，lnc030在BCSCs中高表达，并且与乳腺癌恶性肿瘤密切相关。
2、lnc030是维持BCSC细胞干性所必需的
为了检验lnc030在保持BCSC干细胞性中的作用，在图2A中，他们使用两种独立的慢病毒介导的短发夹RNA敲除Hs578T、BT549和MCF7中的lnc030。图2B~G显示，敲低lnc030显著降低了多能转录因子如c-Myc、KLF4和SOX2的表达并且乳腺球形成效率显著降低，抑制了细胞增殖。此外，可以从图2H~I中看出lnc030高表达的乳腺癌组织中检测到ALDH活性增加，并且分离的乳腺癌细胞比lnc030低表达的乳腺癌细胞具有更高的乳腺球形成能力。这些结果表明，lnc030在维持BCSCs的干细胞性中起着至关重要的作用。
3、lnc030促进SQLE表达，维持BCSCs干性
lncRNA可通过调控其邻近基因参与肿瘤的发生发展。为了分析lnc030是否调控其邻近基因角鲨烯环氧化酶（SQLE），他们首先评估了lnc030敲低或过表达是否影响SQLE表达。图3A~B显示，lnc030敲低显著降低SQLE表达。此外，可从图3C~I发现，在SQLE敲低的BCSCs中，c-Myc、KLF4和SOX2蛋白表达显著降低，细胞成球效率、细胞球大小以及数量均显著减少；而过表达SQLE逆转lnc030敲低的作用。这些数据提示lnc030可能通过调控SQLE参与BCSC的干细胞维持。
4、lnc030与PCBP2相互作用增加SQLE mRNA稳定性
接下来，研究者继续探究lnc030如何增加SQLE表达式。在图4A中，他们采用放线菌素D处理不同时间lnc030敲低或过表达的Hs578T细胞，发现lnc030的敲低导致SQLE
mRNA的半衰期明显下降，而lnc030的过表达使其半衰期显著延长。图4B~D通过RNA
pull-down，SDS-PAGE和质谱分析确定了潜在的RNA结合蛋白（RBP）——PCBP2，它与体外合成的lnc030共沉淀；且RIP实验证实，PCBP2确实在Hs578T或BT549球中富集了lnc030。紧接着，进行生物素标记的特异性针对lnc030的反义DNA探针下拉实验，图4E显示，在下拉沉淀中可以检测到SQLE
mRNA和PCBP2。此外，图4F~J显示lnc030的敲低大大降低了RIP复合体中PCBP2与SQLE
mRNA的结合；缺失定位分析和RNA下拉结果显示，lnc030片段301-412nt（Del3）可以与PCBP2结合；在非活性区建立了带flag标记的全长和3个截断的PCBP2片段相互重叠；RIP实验显示lnc030主要结合在PCBP2的KH2（T2）上，SQLE主要结合在KH3结构域（T3）上；含有3'-UTR的SQLE
mRNA探针特异性地下拉PCBP2，而不是5'-UTR或CDS区域。并且，图4K的体外结合实验表明，lnc030可以增加PCBP2与SQLE
3’-UTR之间的结合，而不是其反义RNA。这些数据表明，lnc030、PCBP2和SQLE
3'-UTR可以形成三元配合物，lnc030促进了PCBP2与SQLE的相互作用。lnc030通过与PCBP2的相互作用调节SQLE
mRNA的稳定性。
5、细胞内胆固醇促进BCSCs干性维持
SQLE是胆固醇合成的关键限速酶。图5A~C显示，在Hs578T、MCF7和BT549细胞中敲低lnc030或SQLE，可显著减少细胞内胆固醇；而乳腺肿瘤组织中的胆固醇浓度高于正常组织。此外，可从图5D~G发现，与lnc030低表达的乳腺肿瘤相比，高表达lnc030的乳腺肿瘤的胆固醇浓度更高；并且无论是经过lnc030敲低，还是SQLE敲低处理的Hs578T、MCF7和BT549细胞，外源增加胆固醇均可上调c-Myc和KLF4的表达，且存在剂量依赖，同时还可以提高乳腺癌细胞球形成效率。另外，图5I结果表明，在乳腺癌肿瘤组织中，胞内胆固醇的浓度与ALDH的活性呈正相关。综上所述，在乳腺肿瘤中，lnc030介导胆固醇增加，从而促进BCSC的形成和干性的维持。
6、lnc030通过PI3K/Akt信号通路维持BCSCs干性
图6A~B的研究结果表明，在lnc030敲低的BCSCs中，磷酸化PI3K（p-PI3K）和磷酸化Akt（p-Akt）的水平显著降低；SQLE敲低的BCSCs中也有同样的结论。这表明PI3K/Akt信号通路位于lnc030-SQLE信号通路的下游。此外，图6C~D显示，在lnc030敲低的BCSCs中，过表达SQLE及用胆固醇外源性干预，发现两者均能上调p-PI3K和p-Akt的表达；在SQLE野生型BCSCs中，过表达lnc030可导致p-PI3K和p-Akt表达水平上调；在SQLE-敲低的BCSCs中，过表达lnc030则不能增加其表达。这表明SQLE参与调节lnc030激活PI3K/Akt信号通路的过程。综上所述，lnc030/SQLE信号轴通过PI3K/Akt信号通路维持BCSCs的干性。
7、lnc030-SQLE-胆固醇促进乳腺癌的发生和发展
为了研究与CSC相关的lnc030的促肿瘤能力，图7A显示，作者在小鼠中进行有限稀释试验。有限稀释法是一种常用的克隆方法，将需要再克隆的细胞株自培养孔内吸出并作细胞计数，计出1mL的细胞数，可用来筛选融合的动物细胞。图7B~E的结果表明，小鼠注射lnc030敲低的BCSC后，裸鼠肿瘤的发生减少；高脂肪、高胆固醇饮食（HFD）和过表达lnc030的CSC则促进小鼠的乳腺肿瘤发生；对于过表达lnc030的小鼠，对注射的肿瘤细胞进行SQLE敲低则可抑制肿瘤的生长。此外，图7F~H显示，SQLE、p-PI3K、c-Myc和KLF4蛋白的表达水平与其植入的肿瘤干细胞特征一致。综上所述，证实了lnc030-SQLE-胆固醇信号刺激PI3K/Akt的激活，参与BCSC干性维持，并促进了乳腺肿瘤的发生和生长。靶向CSC特异性lnc030及其下游信号通路可能是乳腺癌的一种有效治疗手段。
四、研究小结
该研究通过lncRNA/mRNA微阵列检测，鉴定出一种新型lncRNA（命名为lnc030），该lncRNA在体外和体内均在BCSCs中高表达，是维持BCSC干细胞性和促进肿瘤发生的关键调控因子。机制上，lnc030与PCBP2协同稳定SQLE
mRNA，导致胆固醇合成增加。升高的胆固醇反过来激活PI3K/Akt信号，其控制BCSC的干细胞性。综上所述，这些发现表明了一种新的、基于lnc030的调节BCSCs胆固醇合成和干细胞特性的机制。lnc030-SQLE-胆固醇合成途径可能作为BCSC消除和乳腺癌治疗的有效靶点。
五、国自然中标情况
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