肿瘤细胞转移过程

　　其中细胞侵袭便发生在第一步，即肿瘤细胞在原位突破基底膜，然后内渗进入血管、淋巴管的过程，后期才开始进行转移。本期我们就为大家讲述利用transwell小室模拟细胞侵袭的实验方法。

　　Transwell侵袭实验的原理和过程

　　transwell原理简单来说，将transwell小室放入培养板中，并将高营养液与低营养液用一层膜隔开，细胞放在低营养液中，而为了获更多的营养，细胞则会穿过这层膜，进入高营养液。细胞transwell实验，可作为一种非常简便的研究肿瘤细胞迁移、侵袭以及转移情况的方法。transwell小室的结构示意图如下左图；

　　下右图为利用血清为诱导因子，模拟肿瘤细胞侵袭的过程。简单来说即：膜可以将上下室的营养液隔开，如下室常为有血清培养基。这样细胞放无血清的培养基里，为了吃的更好会往下跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。此时膜上涂一层基质胶，就可模仿细胞外基质，细胞必须要把基质消化了才可跑到下室，最后计算下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。

　　Transwell侵袭实验的具体步骤

　　一、实验材料（提前1天准备）

　　a）Transwell小室

　　b）基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，需要提前12h将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜。因其4℃时是液体，在 37℃会逐渐凝固成胶状，且不可逆。它能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了；

　　c）上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，可以加入0.05%-0.2%BSA；

　　d）下层培养液：下层培养液采用含5%－10%FBS的培养基，具体浓度根据细胞转移力而定，转移力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子“引诱”细胞转移，如将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子；

　　e）细胞培养板：常用6孔板、12孔板、24孔板等。其中，以24孔板最常用，下面就以24孔板为例。

　　二、操作步骤

　　1.铺基质胶：在4℃条件下将Matrigel胶用无血清的细胞培养基或PBS缓冲液按照1：8比例稀释（其稀释比例需要摸索，选择一个细胞穿过适中的浓度即可），取100μl均匀涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面，37℃放置0.5-1h，使其聚合成凝胶；

　　Tips:

　　a) 将枪头沿小室内壁将Matrigel轻轻打出，切忌戳到小室滤膜；

　　b) 加入的Matrigel胶的体积不可太大，把聚碳酸酯膜浸湿即可；

　　c) 注意低温，枪头、小室等都应该4℃预冷。

　　2.细胞培养：取对数生长期的待测细胞，并用PBS洗涤，接着用无血清培养基悬浮细胞，调整细胞密度为1-10*105/ml；

　　3.接种细胞：在24孔板下室一般加入500-650 μL 含 5%-10%FBS 或趋化因子的培养基，然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内，取细胞悬液100－200μL 加入上室，最后放入培养箱中培养12-48h（根据癌细胞的转移能力而定）。

　　Tips:

　　a) 尽量避免气泡的产生：下层培养液和小室间常会有气泡产生，会影响下层培养液的趋化作用。因此一旦出现大气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板；

　　b) 注意细胞一定要接种均匀，建议沿着壁缓慢加入；

　　c) 时间点的选择除了要考虑到细胞的转移能力以外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视，如某些药物会抑制细胞的增殖。

　　4.细胞固定：取出小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭Matrigel和上室内的细胞。取新的24孔板加入4%多聚甲醛600μL，将小室放入后固定20-30min。

　　5.细胞染色及计数：弃固定液，用0.1-%0.2%结晶紫染色5-10min，PBS洗3遍，除去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检。适当风干后，在高倍显微镜下选取5个视野观察细胞并计数。