在再生医学领域，细胞疗法正日益成为各种疾病的传统疗法的可行替代疗法。最近，T 细胞已成为许多临床投资的重点，用于血癌的嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞免疫疗法，但其他细胞类型包括间充质干细胞 (MSC) 和其他免疫细胞（即 NK 细胞、巨噬细胞）的治疗潜力也已被研究。无论细胞类型如何，了解在体外培养细胞以实现最佳细胞活化和扩增，同时保持功能的最佳方法是这些“活药”成功的关键。

　　成功的关键之一在于分离后用于培养这些细胞的细胞培养基。由于每种细胞类型都有影响其生长、活力和功能的独特要求，而且细胞本身就是治疗，因此有必要对细胞治疗开发过程中使用的培养基进行额外的审查。有各种各样的细胞培养基可供选择，从自己动手的配方到市售的一刀切的完整配方。由于成分的多样性和每种细胞类型的多种选择，在为您的细胞类型确定最佳培养基时，导航可能是一个具有挑战性的环境。

　　此外，许多开发细胞疗法的公司正在寻求通过开发同种异体细胞疗法来降低当前自体细胞疗法的非常高的 COG，这将允许更好的可扩展性和标准化，但仍然存在安全性和有效性问题。有严格的安全和监管指南限制某些可能对患者造成健康风险的添加剂，不得包含在细胞培养基中。这导致对开发无异种和/或化学成分确定的培养基替代品的投资增加。再次强调细胞培养基在任何基于细胞的疗法的开发、制造和商业化中的重要性。忽视这一方面和未能适当规划可能会导致细胞疗法的性能和质量不一致，并阻碍其通过监管批准成功推进。这些挑战最终会降低上市速度，这对细胞疗法尤为重要。

　　代谢组学分析的兴起以提高临床成功率

　　与使用克隆细胞系的传统生物制药制造不同，使用原代细胞和干细胞的细胞疗法存在一些独特的挑战，特别是在自体环境中。离体细胞扩增、分化和功能激活的程度可能因患者而异，其中起始细胞有限且通常健康状况不佳。由于细胞培养基配方会影响细胞特性（即生长动力学、健康状况和功能特性），因此人们对代谢组学重新产生了兴趣，以更好地了解各种培养基添加剂（如葡萄糖、氨基酸、维生素和二肽）对关键细胞的影响。影响治疗效果的质量属性 (CQA) 1,2代谢对 CAR T 细胞功效的影响对于提高用于过继免疫治疗的 T 细胞的质量具有重要意义。已发现治疗性 CAR T 细胞的效力会因制造过程中存在于培养基中的外在因素而增强3。对调节基因转移、代谢适应性、效应器功能和持久性的代谢机制的透彻了解可能有助于逐步改进用于离体 T 细胞生产的细胞培养基。用于治疗应用的各种培养基配方值得进行比较代谢分析，以更深入地了解对影响每个特定目标细胞代谢的外源营养水平的贡献。

　　代谢分析有用的另一个领域是在工艺开发阶段，为细胞培养基配方的实验设计 (DOE) 优化提供信息，以提高整体制造成功率。毛细管电泳与质谱联用 (CE-MS) 是一种用于代谢组学研究的快速新兴分析工具，可以更深入地了解细胞培养基，能够高效、高速地分离分析物。来自 908devices 的在线 CE-MS 设备 REBEL 可以快速定量氨基酸和维生素，并且有可能比传统的基于 HPLC 的分析更快地定量其他介质成分。4 .

　　例如，精氨酸已被确定为 T 细胞增殖的关键氨基酸，因此需要将其包含在 CAR T 工作流程中用于体外扩增的培养基配方中，以获得激活和基因操作所需的细胞数量5,6。然而，如图 1 所示，可以在一组市售培养基配方中找到范围广泛的精氨酸浓度，这可能对 T 细胞性能产生重大影响。

　　图 1. 4 种不同商业 T 细胞制剂的氨基酸分析显示氨基酸精氨酸的浓度范围很广，这对于 T 细胞活化和增殖至关重要。误差线来自 n = 5 次重复的标准偏差。所有培养基样品在 REBEL 分析前稀释 25 倍，无需额外样品制备。

　　CAR T 细胞疗法治疗血液系统恶性肿瘤的空前疗效也促使科学家研究这种治疗实体瘤的方法。然而，已证明 T 细胞难以克服免疫抑制性肿瘤微环境。因此，正在制定策略来改善 T 细胞代谢适应性，以通过在体外预适应培养基中的细胞来克服敌对的肿瘤微环境 (TME)，该培养基更能反映 TME 的氧气和营养状态以启动它们一旦重新输注回患者体内，就会获得更有效和更强大的抗肿瘤反应6,7. 对市售 T 细胞培养基配方的代谢分析表明它们不能反映生理条件，因此可能需要微调以确保 CAR T 细胞在体内准备就绪。

　　人类间充质干细胞 (hMSCs) 的临床应用也得出了类似的结论。间充质干细胞是多能成体干细胞，由于它们既能分化成独特的间充质表型，又能通过分泌生物活性化合物来诱导再生微环境，因此在组织工程应用中具有广阔的治疗潜力。然而，临床成功受到细胞存活率低和移植到损伤部位后植入的阻碍。移植的 MSCs 经历了一个充满敌意、受损的缺血（缺氧和营养物质）、炎症和氧化应激的微环境，这对细胞产生了负面的代谢压力，影响了它们发挥积极治疗作用的能力。8 .

　　新鲜媒体分析

　　血清去除

　　对于临床应用，行业正在转向排除血清和其他动物源性原材料成分的细胞培养基平台，以建立更明确的生长参数，以提高一致性、减轻污染和免疫原性风险，并降低 COGS。

　　用于分离和扩增的常规培养基通常包括补充 5-20% (v/v) 的胎牛血清 (FBS)。FBS 是一种广泛使用的培养基添加剂，因为它含有高水平的附着和生长所需的营养和理化化合物。然而，将动物血清用于临床使用自体或同种异体人血液衍生材料引起的安全性和监管问题增加了人们对确定确定的无血清培养基配方的兴趣。应使用合理和系统的方法来确定关键因素及其浓度，着眼于设计理想配方、确定的无血清培养基。9,10。与其他定量方法不同，REBEL 具有 5-100uM 的灵敏检测动态范围，可准确检测低水平的氨基酸和其他营养物质，不受血清蛋白的干扰。

　　图 2.用于 T 细胞扩增的五种含有和不含血清的培养基配方中的氨基酸分布。误差线来自 n = 5 次重复的标准偏差。所有培养基样品在 REBEL 分析前稀释 25 倍，无需额外样品制备。借助 REBEL 的这一快速洞察，研究人员可以就哪种培养基平台最适合生长 CAR T 细胞做出明智的决定。

　　在细胞疗法制造中实施定义的培养基配方将提高细胞生物处理协议的一致性，提供更统一和可控的环境，这可能对提高临床疗效至关重要。

　　媒体优化

　　专注于培养基开发的另一个原因是优化配方以最大限度地扩展您的细胞类型以增加产量，同时降低商品成本 (COGS)。在自体环境中，每位患者的健康状况和人口统计数据都转化为独特的细胞群，这为随后的细胞疗法制造过程带来了可变性，强调了过程控制的重要性，以确保在每次制造过程中生产出一致的药物产品即使存在这种可变性。过程分析技术 (PAT) 可以在整个制造过程和 QC 放行测试中提供关于关键质量属性 (CQA) 的可见性和信息，其中速度、需要准确性和吞吐量来为优化工作提供实时过程反馈并加快产品发布。PAT 在质量源于设计 (QbD) 框架内的重点突出了对更好的分析工具的需求，这些工具可以允许快速和频繁的监控以实时通知流程开发。当前的分析方法在采样和数据生成之间存在从数天到数周的长滞后时间，这对有效的实验设计 (DOE) 方法来说是不利的。此外，这些分析可能缺乏显示可能由增量过程优化步骤导致的细微变化所需的分辨率。PAT 在质量源于设计 (QbD) 框架内的重点突出了对更好的分析工具的需求，这些工具可以允许快速和频繁的监控以实时通知流程开发。当前的分析方法在采样和数据生成之间存在从数天到数周的长滞后时间，这对有效的实验设计 (DOE) 方法来说是不利的。此外，这些分析可能缺乏显示可能由增量过程优化步骤导致的细微变化所需的分辨率。PAT 在质量源于设计 (QbD) 框架内的重点突出了对更好的分析工具的需求，这些工具可以允许快速和频繁的监控以实时通知流程开发。当前的分析方法在采样和数据生成之间存在从数天到数周的长滞后时间，这对有效的实验设计 (DOE) 方法来说是不利的。此外，这些分析可能缺乏显示可能由增量过程优化步骤导致的细微变化所需的分辨率。

　　花费媒体分析

　　基于靶向代谢组学的 PAT 允许通过废培养基分析在整个制造过程中对 T 细胞进行代谢分析。特别是随着大规模商业制造采用更加自动化和封闭的过程，可以在线或在线操作以最大限度地减少手动处理时间的分析工具是可取的。传统上，参与过程开发的团队无法获得此类分析所需的必要分析工具或资源。将分析外包给核心实验室或 CRO 从样品到结果可能需要数天到数周的时间，这可能会严重延迟流程开发和 PAT 实施工作。

　　REBEL 专为特定目的而设计，能够从生物反应器进行频繁的在线测量，以主动、近乎实时地监测 CQA，这对治疗效果和安全性有直接影响，以确保产品质量和批次间的一致性. 其小型、独立的占地面积适合与生物反应器一起使用，并能够快速分析样品，以对超过 30 种分析物（包括所有关键氨基酸、生物胺、水溶性维生素和二肽）提供准确和可重复性的定量鉴定和分析（图 3）。将数据报告功能与便携式报告格式和自动化性能鉴定以及符合 21 CFR Part 11 的软件相结合，使 REBEL 易于集成到 cGLP/cGMP 环境中。

　　图 3. REBEL 分析仪在化学成分确定的介质中测量的平均氨基酸浓度。制备了 6 个培养基样品，分 6 次分装到 96 孔板中，REBEL 对每个样品进行 5 次重复测量 (n=180)。显示了检测到的每种氨基酸的平均浓度和标准偏差。

　　扩大规模和扩大规模是增加细胞疗法产量的两种模式，每种模式都有其独特的挑战。横向扩展涉及并行增加操作单元的数量以增加容量，而纵向扩展会增加操作单元的大小，这通常意味着迁移到与小规模生产中使用的不同的更大培养容器。横向扩展选项易于实施，因为培养参数不会改变，但横向扩展模型的低效率可能会导致 COGS 增加，无法满足长期产品需求。在扩大到更大的生物反应器平台的过程中，容器尺寸、搅拌和其他生理参数的变化会影响生长和细胞性能，这可能需要广泛的工艺优化以确保仍然满足 CQAs。