在过去的二十年中，蛋白质生物制剂市场呈爆炸式增长，现在是治疗领域增长最快的部分。中国仓鼠细胞 (CHO) 已成为市场上大多数蛋白质治疗药物（如单克隆抗体 (mAb)）商业生产的首选宿主细胞系。¹ HEK 293 和 Vero 等其他细胞系也发挥着重要作用。它们通常用于生产非 mAb 产品，例如球状蛋白、病毒载体疗法和疫苗。²

　　细胞培养基优化的影响：生产力、质量和整体成功

　　Harry Eagle 的早期工作首先证明了培养基成分在培养细胞生长中的重要性。3,4在他的发现中，Eagle 报告说 13 种氨基酸对细胞生长至关重要。Richard Ham 强调了成分选择和优化在 F12 开发中的重要性，F12 是一种全合成、化学成分明确的无血清培养基，用于单细胞培养和 CHO 细胞培养物的扩增。然而， 5 F12 培养基不太适合支持细胞生长至高于 10 5 个细胞/mL 的密度。6Sato 及其同事通过补充激素和生长因子以及将 50:50 与 Dulbecco 的 MEM (DMEM) 混合，创造了改进的配方 DMEM/F12，DMEM 提供了更高水平的关键氨基酸和维生素以及额外的微量金属。7

　　自从这些早期成就以来，为生物生产而设计的无血清培养基得到了进一步的发展，并大大提高了细胞活力、生长和生产力。现在已经积累了大量知识，特别是对于 CHO 细胞，这证明了培养基成分的重要性。在某些情况下，这些努力在将 mAb 滴度产量从 ~ 1 g/L 提高到更高的 10 g/L 方面发挥了重要作用。

　　培养基研究表明，成分组成及其各自和相对浓度可以显着改善或降低培养基性能。效果不仅限于能量成分（葡萄糖、谷氨酰胺等）作为氨基酸，其他成分也有关键作用。来自 MIT 和 U. Minn. 的小组率先根据营养需求对基础和饲料配方中的细胞生长和氨基酸利用进行化学计量分析的概念；从而防止关键营养素的消耗，同时最大限度地减少有毒代谢废物。8-10还开发了其他方法，例如代谢、基因分析等。这些研究表明，必需和非必需氨基酸组成都可以对细胞代谢产生显着影响，因为培养基中的氨基酸水平会改变通路。6,11

　　文献中有许多关于氨基酸浓度对 CHO 细胞代谢和生产的重要性的例子，这表明将大多数氨基酸维持在特定浓度范围内对于 CHO 培养非常重要 [综述见 (6)]。因此，关键的不是氨基酸的总量，而是满足单个细胞系6、12、13或单个细胞克隆需要的平衡组成。14

　　氨基酸还可以在蛋白质合成和能量来源之外的其他细胞功能中发挥作用。报告表明，一些氨基酸可以作为信号分子，并可能影响细胞凋亡率和其他细胞参数。15研究人员还发现，某些浓度的氨基酸可以提供一些保护，防止氨6,12或渗透压升高。12,16 Chen 和 Harcum 报告说，20 mM 水平的 Thr、Pro 和 Gly 能够减轻氨的负面影响。17McAtee Pereira 表明 Gln、Glu、Asn、Asp 和 Ser 水平可以减少氨的产生，同时保持细胞碳通量23。其他人发现必须注意避免过量的某些氨基酸如 Asn 和 Gln，以避免有害废物的过量产生。6,11请注意，某些氨基酸如 Cys、Tyr、Trp 的溶解度可能较低，而另一些在某些配方中可能不稳定（Gln、Cys），这些需要在培养基中仔细监测 [有关溶解度的评论，请参阅 ( 18)]。

　　研究还表明，mAb 质量属性（例如糖基化模式、聚集和电荷变异）也会受到培养基成分的影响。2,13,19-21除了氨基酸，其他例子还包括维生素、生物胺等。例如，维生素胆碱的消耗会对 mAb 滴度和 mAb 聚集产生显着影响。22,23因此，人们一直在努力优化培养基配方，以实现高水平和高质量的生物治疗药物的生产。对培养基优化的投资和对培养基成分的控制，可以对生物生产工作的整体结果产生巨大影响——以及缩短发育途径

　　介质成分分析的重要作用

　　当前化学成分确定的生产培养基通常包含 50 -100 种成分，其中包括糖、氨基酸、维生素、生物胺、金属、缓冲剂等。6典型的培养基优化工作通常涉及多轮优化，通过分析用过的培养基并监测补充或减少单个成分对预期培养结果的影响。由于大量的培养基成分和更多的可能的浓度依赖性组合，优化可能是一个复杂且耗时的过程。实验设计 (DOE) 可用于在一定程度上减少工作量。6,13,24开发数学模型（数字双胞胎）的方法将进一步有助于减少物理实验的数量，但也需要细胞培养系统的输入。33  然而，从头开始的中等开发工作可能需要数月才能实现高度优化的配方。

　　生产的全面优化超越了基础培养基。开发基于饲料的策略，在指数生长期和生产阶段以优化浓度呈现成分，可以显着改善，有时会达到几倍。13,22,25因此，培养基组成、培养基优化以及监测和控制程度26会对细胞代谢、细胞健康以及产品生产和质量产生深远影响。

　　该培养基还需要支持从单细胞克隆、克隆选择到小型生物反应器27（Ambr© 型）中的扩展、台式生物反应器和大规模的扩大努力。这可以包括在 N-1 或生产容器中的灌注生物反应器，它们使用培养基交换来通过去除有毒代谢物来提高细胞密度和产量。28,29在整个开发和生产阶段优化和监控媒体的努力可以在流程开发的每个步骤中产生巨大的收益。

　　对监测培养基成分的在线高效分析能力的需求是开发、优化和控制培养基配方的核心。这种对稳健分析方法的需求因每个细胞系/克隆可能具有不同的代谢需求这一事实而更加复杂，因此在多线生产环境中的需求更加复杂。遗憾的是，由于工作流程不佳、成本或时间限制，目前的大部分生物生产都没有完全优化配方。由于仅从细胞生长曲线中的一个或两个时间点取样培养基，配方也经常未优化。这样的例子是生长末期或培养末期，这两者通常都位于细胞生长曲线的最高产阶段之外。早期开发侧重于速度，通常使用现成的商业配方。后期开发侧重于进一步优化，但成本和缺乏可访问的分析可能会阻止全面优化。因此，由于缺乏稳健的分析解决方案，目前使用的许多介质并未完全优化。

　　经典分析方法的局限性

　　最常用的培养基成分定量方法是经典方法。通常，HPLC。这种方法需要经验丰富的操作员、条件优化、氨基酸标记试剂的使用以及每种组分的专用色谱柱。虽然 HPLC 方法很有效，但由于可能需要专门的设施，它们可能很昂贵。由于任务的复杂性或测试设施的积压，样品周转通常不如预期。这些延迟反过来又会对流程开发时间表产生负面影响。此外，这些经典方法的样本量要求可能不允许频繁分析来自小型开发平台（如微生物反应器）的样本。

　　外包量化是一种选择，但它既昂贵又耗时，因为它涉及冷冻样品的运输，并且最终使用同样耗时的经典方法进行分析。额外的发货时间进一步延长了媒体优化的时间线。因此，这些经典策略通常不提供可操作的数据，因为可能需要数天到数周才能收到测试结果。

　　为了解决当前的测试问题，908 Devices 的 REBEL 分析仪使用微芯片毛细管电泳结合高压质谱仪 (CE-HPMS) 来简化介质分析。Rebel 可以在几分钟内分析包含多种氨基酸、维生素和生物活性胺的面板。这种新的、负担得起的、易于使用的技术提供了多种好处，并且可以大大缩短培养基和饲料开发的时间。这种在需要时可用的分析方法的可负担性支持在生产时间过程中分析更多时间点。此外，Rebel 近乎实时的能力和较小的占地面积能够实现在线分析，进而可以支持过程分析技术 (PAT) 策略和缓解策略的潜在应用，

　　可用于媒体开发的三种通用方法

　　通常，有三种选择来实施生物加工应用的媒体开发工作，其中包括：1) 使用现成的商业媒体和饲料，2) 外包媒体开发，或 3) 内部媒体开发。

　　现成的媒体

　　市场上有许多现成的媒体和提要。它们的局限性在于它们是使用供应商的细胞系/克隆和供应商的开发系统（生物反应器和工艺）开发的。因此，商业配方针对其他人的细胞系进行了优化，而不是您自己的。13

　　这可能会导致这些配方在您自己的生产线中表现不佳，并且可能需要对多家供应商的培养基进行广泛筛选，以确定合适的配方。此外，同一细胞系（例如 CHO）的克隆之间营养需求的差异可能会使现成解决方案的稳定性进一步复杂化。已经表明，氨基酸很容易在一些现成的培养基中耗尽。13

　　使用现成的媒体并不会消除开发工作，因为通常必须筛选几种媒体和提要以最大化预期的结果。13这种方法的另一个限制是您不知道完整的配方和成分清单。因此，治疗生产商缺乏对其细胞系统及其过程的全面了解，并且无法确定其生产是否得到充分优化和控制。有时，治疗生产商会发现没有令人满意的现成选择来提供所需的结果。

　　使用现成策略的主要优势是节省时间和费用。使用预先制定的解决方案可以通过缩短开发时间来缩短上市时间。它们还可以降低成本，特别是短期成本，可能会带来更高的总体成本。

　　外包媒体优化

　　外包媒体优化导致定制机构特定“平台媒体”的进步，可以提供比现成解决方案更高的性能。但是，此解决方案也有局限性，因为培养基仅针对发送的细胞系/克隆进行了优化。即使有经验丰富的服务提供商，媒体的全面优化也可能需要几个月的时间。此外，治疗生产商将无法从发育过程中获得其细胞系的第一手知识。

　　由于这些外包配方被开发为提供给他们的克隆，在他们的生产容器中，在培养规模化过程中经常存在使用问题。选择和扩增过程早期的细胞可能具有与小规模培养截然不同的营养需求，同样来自在高密度多 1000 升生物反应器中生长的细胞。通过为每个需求阶段开发特定的媒体，可以在一定程度上缓解这个问题。生产商为生产阶段开发几种配方和饲料并不少见，然后对其进行筛选和进一步优化，类似于现成的解决方案，以减轻内部克隆变异。

　　内部媒体开发

　　与其他选择相比，内部开发具有明显的优势，因为治疗生产商获得了他们细胞系的知识，将了解配方，并且可以合理地确定优化技术被执行到高水平。然而，这种方法有局限性，例如需要获得专家人员和分析能力。如果需要复杂的设备构建，时间线可能比其他解决方案更长。然而，购买具有在线能力的中等分析设备可以提供长期利益，因为它可以在产品生产过程中作为过程分析技术 (PAT) 战略的一部分使用。26,30

　　组合方法

　　通常可以考虑多种策略的组合，例如外包开发，限制现成的组件，而不是创建高度优化的自定义媒体。其他组合策略可能包括在生产早期使用现成的解决方案以加快上市速度，然后使用完全优化的介质来提高效率并降低长期成本。

　　媒体质量控制测试

　　cGMP 培养基的 QC 测试通常由服务提供商执行，非 GMP 开发培养基的 QC 通常可以额外收费进行。然而，这是一种对任何获得的培养基进行自我验证的聪明方法，因此可以避免开发或生物生产中可能出现的错误。研究发现，现成培养基中成分的预期水平存在很大差异。一些结果显示高达 2.5 倍的预期水平，而另一些则根本不存在。31为此，Rebel 分析仪也很有价值，因为它可以在短短几分钟内现场分析包含数十种媒体成分的强大面板。这提供了最大的信心，即购买的媒体是按承诺组成的，并且额外的批次将按预期执行，从而减少任何可能的性能变化。

　　细胞培养基分析和过程分析控制 (PAT)

　　美国食品和药物管理局 (FDA) 的过程分析技术 (PAT) 倡议推动了深入了解生产过程对产品质量的影响，该倡议在 2004.32 的行业指南文件中引入。该框架旨在通过对过程的实时监控来确保药品的质量。26识别过程中的可变性来源、可变性管理以及确定产品质量是否可能受到影响是 PAT 的组成部分。26

　　目前可以通过在线传感器或使用生物分析仪对培养液进行近线分析来测量许多生物反应器条件，例如 DO、温度、电导率、pH、pO2、pCO2、代谢物、细胞活力、密度和生产力。为了对培养基条件进行更深入的分析，Rebel 等培养基分析仪可以对超过 30 种不同的氨基酸、维生素和生物胺进行近乎实时的分析（7 分钟）。

　　Rebel 占地面积小，还可以在线使用，分析仪可以与其他分析设备一起放置在工作台或工作台面上，或者放置在推车上以便移动到不同的位置。此外，该设备只需要 10 µL 的样本量，这只是已经用于其他生化分析的样本的一小部分。支持集成到 PAT 计划的其他方面包括：简单的操作（加载并按下按钮）、24/7 可用性（与许多内部分析设施不同）、为 cGMP 合规性而设计的软件支持 21 CRF 第 11 部分数字文档和 .CSV 文件格式，用于集成到其他软件系统中。

　　在线介质分析的其他好处

　　用于补料分批培养的优化培养基和补料策略以及用于灌注生物反应器的优化培养基的进步在将体积生产率提高到数克/升范围方面发挥了重要作用。正确构建的培养基策略可以潜在地将生产力提高几倍。这些策略之所以如此有效的原因之一是因为它们确保了培养基成分的存在并保持在最佳浓度。因此，近乎实时的在线分析可用于监控您的进料或灌注策略是否按预期运行。

　　除了监测和控制之外，在线培养基分析还可以为因意外培养基或饲料不平衡而导致的不良事件提供缓解途径。这反过来又可以提高生产活动的整体效率。

　　概括

　　自几十年前生物生产时代开始以来，生产力的大部分提高归功于细胞培养基的优化，以支持细胞健康并最大限度地提高产品生产力和质量。随着培养基配方和补料策略的进步，对强大的分析工具的需求也在增加。许多经典的媒体分析方法繁琐、缓慢、昂贵且有局限性。

　　新的微流体技术，如 Rebel，通过提供近乎瞬时的在线读数，以及在小尺寸内的简单操作设备，已经超越了经典分析方法。介质分析方面的这些进步应该会通过扩展的能力来支持该行业的未来，以确保高生产率和一致的产品质量。