细胞凋亡，通常称为程序性细胞死亡，是一个经过精心调控的过程，是正常发育和体内平衡的一部分。细胞凋亡在形态和生化上与坏死不同，后者反过来称为意外细胞死亡。细胞凋亡的失调与癌症、自身免疫性疾病和退行性疾病等疾病状态有关。

　　细胞凋亡由一系列有序的事件组成，其特征是细胞收缩、细胞通透性增加、膜不对称性的变化、染色质凝聚、DNA 断裂和细胞起泡。最后，通过吞噬作用去除凋亡细胞，组织破坏最小。

　　没有一个参数可以完全定义所有系统中的细胞死亡，因此在研究细胞凋亡时使用几种不同的细胞凋亡测定是有利的。流式细胞术的多参数特性允许测量单个样本中的几种凋亡特征，使其成为研究细胞死亡复杂性的有力工具。

　　您可以表征早期、中期和晚期的凋亡事件；让我们看一些常规使用的最可靠的细胞凋亡检测方法。

　　细胞凋亡中的线粒体变化

　　细胞凋亡早期的一个显着特征是线粒体膜电位的崩溃。标记线粒体变化的探针带正电，导致它们积聚在带负电的线粒体内。JC-1 是一种广泛用于细胞凋亡研究的染料；它在活性线粒体中表现出电位依赖性积累，在 488 nm 激发下发出红色荧光。随着线粒体电位的丧失，JC-1 发射从红色变为绿色，并降低了红/绿荧光强度比。这如图 1 所示。比率变化仅取决于膜电位，而不取决于线粒体数量或大小等其他因素。

　　DiIC 1 (5) (1,1'3,3,3'3'-hexamethylindocarbocynanine iodide) 是另一种在活性线粒体中积累的带正电荷的染料；它是红色荧光，激发波长为 635 nm，荧光强度随电位降低而降低。DiIC 1 (5) 在别藻蓝蛋白 (APC) 通道中读取，因此很容易与其他试剂进行多路复用。

　　MitoTracker™ Red CMXRos是另一种有用的线粒体探针。它在 488 nm 激发下呈现红色荧光，并随着电位的丧失而显示出荧光的减少。MitoTracker™ Red 在藻红蛋白 (PE) 通道中被读取，使其成为另一种易于复用的探针。

　　流式细胞术可追踪细胞凋亡的中间事件

　　从细胞凋亡的早期阶段到中期阶段，您可以测量半胱天冬酶的激活、细胞膜通透性的变化以及细胞膜不对称性的变化。

　　半胱天冬酶依赖性测定

　　一系列细胞溶质蛋白酶（称为半胱天冬酶）的激活是细胞凋亡的标志。半胱天冬酶被合成为无活性的半胱天冬酶前体；在细胞凋亡过程中，前半胱天冬酶被蛋白水解激活。可使用多种荧光检测 caspase 活性，包括PhiPhiLux 系统和  CellEvent ™ Caspase 3/7 Green和NucView 488 Caspase 底物。这些可渗透细胞的底物在 caspase 裂解之前基本上是无荧光的。

　　FLICA（半胱天冬酶的荧光抑制）也是细胞渗透性的，并与带有荧光标签的半胱天冬酶选择性氨基酸序列共价反应。未结合的 FLICA 扩散出细胞并被冲走。

　　膜渗透性测定

　　由于细胞膜通透性增加，三种单体花青染料PO-PRO™-1、YO-PRO®-1和TO-PRO®-3进入凋亡细胞。这些染料一旦进入细胞就与核酸结合，而不能渗透细胞的死细胞染色剂（例如碘化丙啶）则被排除在外。上述三种染料具有不同的激发波长，分别为 405 nm、488 nm 和 635 nm，为多路复用提供了灵活性。

　　膜对称性测定

　　随着细胞凋亡的进展，细胞膜不对称性的丧失发生。磷脂酰丝氨酸（PS）位于活细胞细胞膜的内叶上。随着细胞凋亡的进展，PS 易位或翻转到膜的外叶。用荧光团标记的膜联蛋白 V 通过与外叶上的 PS 结合来识别凋亡细胞。当与不渗透的死细胞染色剂配合使用时，您可以区分活细胞群、凋亡细胞群和坏死细胞群，如图 2 所示。Annexin V 结合取决于缓冲液中钙和镁的存在，因此请务必同时包含两者膜联蛋白 V 测试的阶段。

　　紫色比例膜不对称探针F2N12S是一种新型 405 nm 可激发染料，可检测与 PS 翻转相关的表面电荷变化。与 JC-1 类似，F2N12S 给出两个发射波段；活细胞产生橙色发射，随着细胞凋亡而转变为绿色，并且橙色/绿色发射的比率降低。

　　细胞凋亡接近尾声的流式细胞术分析

　　细胞凋亡的后期涉及核变化，包括染色质浓缩和 DNA 片段化。

　　在形态学上，凋亡细胞的细胞核变得比正常细胞的细胞核小，并在用 UV 激发的 Hoechst 33342 或 405 nm 激发的 Vybrant® DyeCycle™ Violet 染料标记时显示出更高的荧光。当与不渗透的死细胞染料配合使用时，您可以使用这些染色质浓缩检测区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞群。

　　还可以使用TUNEL 测定法（末端脱氧核苷酸转移酶-dUTP 缺口末端标记）检查细胞凋亡中的 DNA 片段化。该测定基于通过末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 在片段化 DNA 末端掺入修饰的 dUTP。一种新的TUNEL 试剂盒使用点击化学，使用 TdT 在片段化 DNA 的末端掺入炔烃修饰的 dUTP，然后使用铜催化的点击反应与叠氮化物标记的荧光团进行检测。

　　流式细胞术成功检测细胞凋亡的技巧

　　要在细胞凋亡检测中获得最佳结果，请使用以下提示：

　　加入对照总是一个好主意，包括可行的和凋亡的，尤其是在使用新的检测、细胞类型或刺激物时。

　　在样品制备过程中，轻轻处理您的细胞，以避免通过操作诱导细胞凋亡。

　　为避免检测后细胞凋亡，请在标记后尽快分析细胞。

　　活细胞的背景荧光通常比未标记的细胞具有更高的背景荧光。

　　请注意，贴壁细胞凋亡的流式细胞术分析提出了独特的挑战，因为细胞去除方法可能会引发错误的凋亡事件。

　　将免疫表型与凋亡检测相结合时要小心；抗体可以非特异性结合死细胞，使解释变得困难。在这种情况下，您可以使用最早的细胞凋亡指标。

　　最后，尽可能确认形态总是一个好主意。细胞凋亡是一个高度可变的过程；所有细胞类型都没有通用的形态学或生理学特征；建议查看细胞凋亡的多个参数。