如果您使用血液显微镜观察外周血的成分，您会发现它由多种不同的细胞类型组成，包括单核细胞。可以分离出这些不同的组件以直接对其进行研究和实验。因此，如果您已经完成了一些实验并且对 THP-1 细胞感到满意，您可以继续直接使用原代人类单核细胞，看看您的工作是否能转化。

　　分离单核细胞需要血液。大量血液，取决于您选择的下游检测方法。产量可能因供体而异（例如，如果他们在献血时感冒了，您可以获得更多的细胞），但平均而言，您可以希望在每毫升整个细胞中分离出大约 1×10 5 个单核细胞人血。

　　在计划您的实验时，重要的是要记住单核细胞的半衰期为 1-3 天。因此，虽然不像其他血细胞那样脆弱（我在看你，中性粒细胞），但最好使用尽可能新鲜的血液。所以，从一个自愿的参与者那里获得了一袋新鲜血液，让我们开始吧！

　　第 1 阶段：从全血中分离 PBMC（外周血单个核细胞）

　　开始隔离 PBMC 之前

　　确保您已签署任何相关的 COSHH 表格，并在处理人体样本时遵守所有安全程序。

　　此步骤大约需要 2-3 小时，具体取决于血液的起始量。

　　分离 PBMC 的设备

　　台式离心机

　　电子枪

　　巴斯德吸管

　　50 毫升离心管

　　血细胞计数器/自动细胞计数器

　　用于分离 PBMC 的试剂

　　隔离缓冲液：磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（不含 Ca 2+ /Mg 2+），辅以 2% 胎牛血清 (FBS) + 3 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)

　　Ficoll® Paque Plus

　　细胞培养基：RPMI-1640，辅以 20% FBS + 100 IU/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素

　　冷冻培养基：细胞培养基 + 10% DMSO

　　分离 PBMC 的协议

　　将 EDTA 添加到全血中，最终浓度为 3 mM。EDTA 是一种螯合剂，它的作用是不可逆地结合钙和镁，在这种情况下会阻止血液凝结。试着忽略可能会出现在你身上的恶心浪潮——用血液工作让我开始感到有点恶心！

　　用隔离缓冲液 1:1 稀释全血。EDTA在这方面的作用与上述相同：结合二价阳离子以防止血液凝结。同样，确保您使用的 PBS 不含 Ca 2+ /Mg 2+（应在瓶子上注明）。最后，FBS 是一种含有丰富生长因子来源的补充剂，可在分离过程中保持细胞快乐和健康。

　　在 15 ml 密度为 1.077 g/ml 的梯度介质（最常用的是一种称为 Ficoll® -Paque Plus 的介质，它足以满足大多数应用；但是，也有溢价已通过 ISO 13485:2012 质量管理体系认证的版本）在 50 毫升离心管中。密度梯度离心是从全血中分离细胞类型的好方法。在这种情况下，粒细胞和红细胞的细胞密度高于单核细胞；因此，在离心过程中，它们将通过密度梯度介质沉淀并在底部沉淀。你一定很分层时要轻柔，以免干扰梯度，因此如果您有幸有大量血液可供使用，请耐心等待。不要担心红细胞开始沉淀在试管底部，因为您需要很长时间。此外，请尽量忽略移液速度如此缓慢而导致手臂抽筋的情况。

　　在室温下以 400 xg 离心 30 分钟，无需刹车。同样，这很重要，以免干扰梯度。这将永远。不是真的，但如果没有刹车，转子停止所需的时间至少与它最初旋转的时间一样长！

　　看到刚刚位于密度梯度介质顶部的云层了吗？那是你的 PBMC。使用巴斯德吸管，直接通过等离子体并“吸住”层。尝试一口气收集所有这些，尽量减少您也吸食的密度梯度介质和等离子体的数量。将您的货物转移到清洁的 50 毫升离心管中（每管最多 10 毫升 PBMC）。

　　添加 3 倍体积的隔离缓冲液并通过反转轻轻混合。清洗 PBMC 的过程会去除任何血浆或密度梯度介质。

　　在室温下以 300 xg 离心 10 分钟（重新打开刹车）并轻轻去除上清液，以免丢失任何细胞。如果立即进行第 2 步，将每个沉淀重悬于 1 ml 缓冲液中，汇集在一起并计数您的细胞。平均产量为每毫升全血1×10 6 PBMC。

　　就个人而言，如果您要沿着磁分离路线分离单核细胞，那么我会继续进行；它相对较快，您不必担心细胞活力。如果您确实需要冷冻 PBMC，请将颗粒重新悬浮在冷冻管中总共 1 ml 冷冻培养基中。将小瓶放入 Mr Frosty™ 冷冻容器中（提供 -1°C/min 的冷却速率）并在 -80°C 冰箱中储存过夜，然后转移至液氮储存。这些是在冻结任何细胞的库存时采取的一般步骤，以确保恢复后良好的细胞活力。恢复后，计数细胞并继续进行第 2 阶段。

　　第 2 阶段：从 PBMC 中分离单核细胞

　　开始分离单核细胞之前

　　如果使用 STEMCELL 的 EasySep™ 人单核细胞分离试剂盒，这大约需要 15 分钟。

　　从 PBMC 中分离单核细胞的设备

　　Big Easy 磁铁（干细胞）

　　15毫升离心管

　　从 PBMC 中分离单核细胞的试剂

　　EasySep™ 阴性选择人单核细胞分离试剂盒 (STEMCELL)

　　从 PBMC 中分离单核细胞的协议

　　PBMC 是任何具有圆形细胞核的血细胞。这包括淋巴细胞（T 细胞、B 细胞、NK 细胞）以及我们所需的单核细胞，它们约占 PBMC 的 10%。从 PBMC 中分离单核细胞的一种快速简便的方法是使用免疫磁性阴性选择细胞分离。有点拗口，但本质上，磁性颗粒可以通过抗体复合物（即负选择部分）抓住不需要的细胞，并且可以使用磁铁将其拉走，留下您的单核细胞，纯净且未触及，并为您的实验做好准备。

　　为什么使用负选择分离单核细胞？

　　免疫磁性阳性选择涉及用识别特定于该细胞类型的细胞表面抗原的抗体复合物靶向您感兴趣的细胞；例如，在单核细胞上表达的 CD14。这些试剂盒的几个例子来自STEMCELL和Miltenyi Biotec。

　　对于这种细胞类型，阴性选择优于阳性选择，因为标记过程可能会冒“激活”单核细胞的风险。有几个套件可以非常有效地执行此任务；但是，它们可能很昂贵。磁铁通常必须单独购买。在您承诺购买任何东西之前，与公司联系询问是否有机会尝试他们的产品样品和磁铁的贷款是没有害处的。我可以亲自担保阴性选择干细胞试剂盒；但是，还有其他可能同样有效的方法。Miltenyi Biotec和ThermoFisher也生产类似产品。

　　由于该过程使用套件，因此简单快捷。以下是使用 STEMCELL 套件的过程的简要概述：

　　确保您遵循试剂盒说明，并在适合您的磁铁大小的体积范围内将您的样品制备成推荐的细胞浓度。

　　您将添加“人类单核细胞分离混合物”，其中包含 Fc 受体阻断抗体和单克隆抗体组合，可识别特定细胞表面标志物以靶向非单核细胞进行去除。Fc 受体阻断抗体很重要，因为单核细胞表达这种受体，因此它们需要被阻断，因为我们希望单核细胞被抛在后面。

　　可以添加可选的“血小板去除鸡尾酒”。当使用从人全血制备的 PBMC 时，建议这样做以实现最佳恢复。

　　在这个短暂的孵育之后，添加磁性颗粒，在步骤 2 中结合抗体。

　　在另一个短暂的孵化后，将试管放置在磁铁内。磁性粒子会将非单核细胞拉走，留下富含单核细胞的细胞悬液，只需将其倒入新试管中即可。

　　这些分离的单核细胞应立即使用；如前所述，它们的半衰期为 1-3 天，因此您希望它们尽可能新鲜。它们适用于用细胞因子激活、用化合物孵育、迁移测定、流式细胞术和更多测定。