什么是支原体？

　　细胞培养是生物研究实验室的基石技术。细胞培养对于研究细胞调节机制、干细胞和再生医学研究以及生产包括疫苗、酶、激素和单克隆抗体在内的生物活性材料至关重要。影响细胞培养各个方面的一个非常常见且通常是灾难性的问题是其他微生物的污染。支原体污染特别令人担忧，因为它难以检测，在细胞培养中经常被忽视，但它显着影响细胞功能。

　　支原体是非常小的、自由生活的原核生物 (0.2-0.4 µm)，没有细胞壁，因此无法用肉眼甚至通过显微镜检测到它们（图 1）。此外，它们不会导致细胞培养基混浊，而混浊通常伴随其他类型的细胞培养污染。最重要的是，支原体感染通常不会导致可观察到的细胞死亡。因此，它们可以在细胞培养皿中增殖并且在很长一段时间内未被检测到，成为进行可靠和准确的体外实验的主要障碍。

图 1. 支原体的结构和细胞器

　　有多种支原体能够感染您的细胞培养物，最常见的是M. orale、M. hyorhinis、M. arginini 和Acholeplasma laylawii。在全球范围内，目前约有 15-35% 的细胞系受到污染。今天，我们知道存在超过 200种支原体物种。

　　支原体效应

　　支原体污染会以多种破坏性方式影响细胞的功能（图 2）。支原体可以改变培养细胞的形态、代谢、膜组成、信号转导、生长和活力。此外，这些生物会影响 DNA、RNA 和蛋白质的合成，并导致染色体改变。支原体还会降低单克隆抗体的产量，影响单克隆抗体的筛选。因此，支原体的存在会极大地阻碍可靠的细胞培养检测的执行，损害蛋白质的产生并阻止产生可重复的实验结果。

　　图 2. 支原体对细胞培养的影响。

　　支原体来源

　　在世界各地的许多细胞系中发现支原体并不意外，因为它很容易传播，而且导致初始感染的来源很多。我们知道，主要来源是将已经携带支原体的细胞培养物引入细胞培养环境，导致支原体扩散到未污染的细胞系（交叉污染）。另一个主要来源是动物血清（胎牛血清或新生牛血清）和细胞培养基。这主要是因为这些材料通常通过过滤进行消毒，但是由于它们的体积小，支原体可以通过一些常用的过滤器。此外，使用非无菌实验室材料；例如，培养箱和移液器也可以将这种生物体引入您的细胞培养物中。

　　有趣的是，细胞系的常规处理也可能导致支原体的引入或传播，因为人类在唾液和皮肤中自然携带支原体。例如，M. salivarium可以在处理培养箱中的细胞培养物时通过说话或打喷嚏传播。实验室人员穿的衣服也可以运送支原体。液氮还能够携带支原体并感染细胞系，因为细胞通常储存和保存在液氮中。最后，暴露于空气中的颗粒物也会导致支原体污染。

　　为什么我们需要敏感的支原体检测？

　　细胞培养和细胞系的使用在生物研究和生物制药产品的生产中是必不可少的。当发生支原体感染时，后果——感染的疫苗、代价高昂的药物开发中断、不可靠的细胞培养试验、不可重复的结果、失去多年的工作、失去宝贵的细胞系——可能是毁灭性的。 此外，支原体对细胞培养中常用的抗生素不敏感。因此，必须每月以最灵敏和最可靠的方法 对细胞系进行支原体的常规检测。

　　鉴定细胞培养中的支原体

　　今天，可以使用具有一系列灵敏度和时间的不同方法测试细胞培养物的支原体污染。在这里，我们讨论最常见的那些（也在表 1 中进行了总结）。

　　表 1. 常用支原体检测方法的灵敏度、优缺点。

　　培养法（琼脂和肉汤法）

　　这是一种常见的技术，被认为是支原体检测的“黄金标准”。通常，来自待测细胞培养物的上清液在支原体培养基中孵育，然后在支原体琼脂培养基上孵育数周。如果在潜伏期后形成菌落，则认为样本为支原体阳性。优点包括灵敏度高、测试简单和成本效益高。然而，这很费力，需要特定的培养基准备，并且需要约 28 天来观察菌落，这可能难以辨别和确定为阳性样本。此外，一些支原体物种在这种琼脂中生长不好，这可能导致得出假阴性结果。

　　使用荧光染料 DAPI 或 Hoechst 染料进行 DNA 染色

　　用 4, 6-diamidino-2-phenylindole-dyhydrochloride (DAPI) 或 Hoechst 33258 进行 DNA 染色是另一种常规用于检测支原体的公认方法。首先，细胞在盖玻片上生长（不至汇合，因为如果支原体未生长至汇合则更容易检测到），然后用 DAPI 或 Hoechst 染色。支原体的存在由细胞周围的荧光和细胞表面上的荧光点指示。

　　该方法易于执行、快速且成本低廉。然而，它的敏感性很低，确定支原体的存在可能是主观的。此外，细菌污染和来自细胞培养中死细胞的降解 DNA 片段可能与支原体混淆。使用荧光 DNA 染色可能难以检测到低水平的污染，从而限制了该检测的灵敏度。

　　图 3.（插图）DAPI 或 Hoechst 染色用于区分未污染（左）和受污染（右）的细胞培养物。

　　间接 DNA 染色是一种比直接 DNA 荧光染色更灵敏的替代方法。在该测试中，指示细胞（例如 NIH-3T3 或 Vero B4）与来自被测细胞的细胞培养基一起生长，然后对这些培养物进行染色。在这种情况下，灵敏度会增加，但是，这种测定是耗时的。

　　酶联免疫吸附试验

　　针对支原体产生的抗体用于酶联免疫吸附测定 (ELISA)。抗体可以与生物素结合，生物素结合链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物，导致磷酸 4-硝基苯酯水解。使用酶标仪确定结果。ELISA 可以非常有助于快速确定细胞培养物是否受到污染，并且可以识别某些特定种类的支原体。然而，这种方法的特异性是有限的，因为可以识别的支原体范围是有限的。

　　免疫染色

　　通过免疫染色进行的支原体检测还涉及抗体，在这种情况下，抗体是针对支原体上特异存在的酶产生的，例如延伸因子 TU (EF-TU)。将细胞固定在载玻片上并与生物素化抗体一起孵育，如果存在污染，该抗体会特异性结合支原体酶。然后，将细胞与链霉亲和素-FITC 一起孵育。然后可以通过显微镜确定由于支原体存在而引起的荧光。

　　该方法快速、灵敏且价格适中。然而，就像在 DNA 染色中一样，染色的解释可能是主观的，这可能导致错误的结论。检测支原体的能力很大程度上取决于污染程度。对污染程度低的培养物进行免疫染色可能难以解释为支原体污染或无支原体。

　　放射自显影

　　放射自显影是一种中等敏感度的技术，要求细胞在盖玻片上生长，并与同位素如 [ 3 H] 胸苷孵育约 3 天。如果存在支原体，核苷磷酸化酶将胸腺嘧啶切割成胸腺嘧啶，胸腺嘧啶被支原体吸收，但不会并入哺乳动物细胞。因此，当存在支原体时，胸腺嘧啶核苷转化为胸腺嘧啶，被细胞表面和周围的支原体吸收，在细胞质（细胞外表面，因为胸腺嘧啶被支原体吸收）中显示为银点，而不是在细胞表面。核。

　　这种方法的优点包括中等灵敏度和在短时间内看到结果的能力。然而，该测定需要使用放射性化合物，并且解释可能是主观的，并且完成该技术并不像其他方法那么简单。

　　生物发光

　　所有生物都需要产生能量的途径才能生存。支原体很大程度上依赖于诸如乙酸激酶和氨基甲酸激酶之类的酶，它们将二磷酸腺苷 (ADP) 转化为三磷酸腺苷 (ATP)。一种简单的生化支原体检测测试基于由这些酶介导的 ADP-ATP 反应，并与萤火虫荧光素酶生物发光反应相结合。在这种方法中，支原体的存在导致乙酸激酶或氨基甲酸酯激酶的 ADP-ATP 转化增加，从而产生可被光度计检测到的生物发光信号。

　　该方法快速、简单且价格低廉。然而，只有在支原体水平相对较高且在检测限 (LOD) 范围内时，才能可靠地检测到污染。另一个限制在于该测试不能指示污染支原体的种类。

　　标准 PCR

　　聚合酶链式反应 (PCR) 是世界各地实验室用于检测细胞培养物中支原体感染的另一种常用技术。这种技术通常比其他支原体检测更受欢迎，因为该程序简单、便宜、敏感、特异性和可重复性。必须设计引物，使其能够识别一系列支原体物种以及无胆原体，但它们必须具有足够的特异性，不会扩增来自可能具有相似 DNA 序列的细菌和其他生物体的序列。此外，还必须包括内部、阳性和阴性对照。

　　PCR确实有一些缺点。PCR 通常需要优化，样品的质量会极大地影响结果的可靠性。因此，建议使用苯酚-氯仿提取或柱提取来纯化 DNA 样品。这种方法也可能导致假阳性，因为可能发生来自非活支原体的扩增或支原体 DNA 的实验室污染。

　　实时荧光定量 PCR

　　如今，实时荧光定量 PCR (qPCR) 是一种首选的支原体检测测试，因为它准确、灵敏且省时。与常规 PCR 不同，qPCR 允许实时观察支原体 DNA 的 DNA 扩增，因为特异性引物在荧光探针存在的情况下与其靶序列结合，从而导致 DNA 扩增和荧光增强。此外，qPCR 比常规 PCR 更具特异性和敏感性。与标准 PCR 一样，支原体 qPCR 需要内部、阳性和阴性对照，并且可能受到实验室支原体 DNA 污染的影响。此外，这种方法确实需要 DNA 提取步骤。

　　等温扩增

　　等温扩增是一种检测方法，无需 DNA 提取步骤即可对细胞培养物中的支原体和无胆原体进行高通量、快速、可靠和准确的检测。与 qPCR 一样，等温扩增需要内部、阳性和阴性对照。此外，它需要与 qPCR 相同的材料。此外，这种方法的灵敏度要高得多，结果非常准确。虽然这种方法成本更高，但它也非常敏感，可以检测到非常少量的支原体，从而获得非常准确的结果。

　　图 4. 支原体检测的等温扩增程序。

　　无论您是怀疑细胞培养物污染还是只是进行常规支原体污染检测，选择敏感且特异的支原体检测至关重要。在引入新细胞系、为实验解冻细胞系以及为发表实验进行实验时，也应进行支原体检测。如前所述，琼脂和肉汤方法被认为是“黄金标准”。但是，这种方法确实有很大的局限性。虽然也存在一些局限性，但最近开发的方法，如实时 PCR 和等温扩增，它们具有高度的敏感性和特异性，确实是一种有吸引力的替代方法。