不了解 DNA 提取试剂盒的工作原理？我们将介绍本文中的基础知识，以便您完善核酸分离并获得高质量的 DNA。

　　我们在 Bitesize Bio 为RNA和DNA提取提供了很多故障排除帮助， 因为我们在分子生物学中所做的几乎所有事情在第一步都需要 DNA 或 RNA，无论是 qPCR、分子克隆、下一代测序还是其他。

　　如今，大多数实验室都使用商业 DNA 提取试剂盒，这些试剂盒使用二氧化硅旋转过滤器方法来获得高质量的 DNA。这些允许快速有效地纯化 DNA（或 RNA）。但这确实意味着许多人只是按照说明进行操作，并不了解 DNA 提取试剂盒的工作原理。

　　为什么您应该知道核酸提取试剂盒的工作原理？

　　离心柱包含选择性结合 DNA 和 RNA 的硅胶树脂，具体取决于盐条件和其他受提取方法影响的因素。

　　当一切顺利时，这些 DNA 提取试剂盒使整个过程比旧的 DNA 提取方法更容易和更快。

　　但是，使用套件的缺点是，如果您不了解套件黑匣子中的内容，则会使故障排除变得更加困难。

　　因此，在本文中，我将详细解释 DNA 提取试剂盒的工作原理以及每一步发生的情况。

　　我还将讨论一些在 DNA 提取中使用硅胶柱所特有的常见问题，只需稍加了解即可克服或避免这些问题。

　　RNA 和 DNA 提取的第一步：裂解

　　裂解公式可能会根据您是要提取 DNA 还是 RNA 而有所不同，但共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。

　　介绍离液剂

　　离液剂破坏氢键、范德华力和疏水相互作用。蛋白质不稳定，包括核酸酶，核酸与水的结合被破坏，从而为转移到二氧化硅创造条件。

　　离液盐包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。

　　不要忘记清洁剂

　　除了离液剂外，裂解缓冲液中通常还有一些去污剂来帮助蛋白质溶解和裂解。

　　添加一些酶

　　根据样品类型，也可能有用于裂解的酶。蛋白酶 K 就是其中之一，实际上在这些变性缓冲液中效果很好；蛋白质变性越多，蛋白酶 K 的作用就越好。

　　然而，溶菌酶在变性中不起作用，因此通常在添加变性盐之前进行溶菌酶处理。

　　关于质粒制备的注意事项

　　关于分离质粒 DNA 的一条评论：裂解与提取 RNA 或基因组 DNA 提取非常不同，因为必须首先将质粒与基因组 DNA 分离。

　　如果你加入离液剂，你会立即释放所有东西，并且无法将小环状 DNA 与高分子量染色体进行差异分离。

　　因此，在质粒制备中，直到裂解后才添加离液剂，并且盐用于结合。

　　这里有一篇关于碱裂解的优秀深入文章 ，还有另一篇关于基因组 DNA 和质粒 DNA 之间差异的文章可供进一步阅读。

　　DNA 提取后进行纯化：将 DNA 与色谱柱结合

　　离液盐对于裂解至关重要，而且对于将 DNA（或 RNA）与色谱柱结合也很重要。此外，为了增强和影响核酸与二氧化硅的结合，还添加了酒精。

　　大多数时候这是乙醇，但有时可能是异丙醇。乙醇百分比和体积有很大的影响。太多，你会带来很多降解的核酸和小物种，这会影响 A260 读数并降低你的一些产量。太少，可能很难洗掉膜上的所有盐分。

　　这里重要的一点是乙醇会影响结合，并且添加量针对您使用的任何试剂盒进行了优化。修改该步骤可以帮助改变您恢复的内容，因此如果您在 RNA 或 DNA 恢复方面遇到问题并想要对其进行故障排除，则可以进行进一步评估。

　　诊断问题的另一种方法是保存结合后的流出物并沉淀它，看看您是否可以找到您正在寻找的核酸。

　　如果您在裂解中使用了含有 SDS 的去污剂，请尝试使用NaCl 作为沉淀剂，以避免去污剂污染 DNA 或 RNA。

　　洗涤 DNA（或 RNA）

　　您的裂解物通过硅胶膜离心，现在您提取的 DNA 或 RNA 应该与色谱柱结合，杂质、细胞蛋白和多糖应该已经通过。

　　但是，膜仍然被残留的细胞蛋白和盐弄脏。如果样品来自植物，膜上仍然会有多糖，可能还有一些色素，或者如果样品是血液，膜可能会染成棕色或黄色。

　　洗涤步骤用于去除这些杂质。

　　通常有两次洗涤，尽管这可能因样品类型而异。第一次洗涤通常含有少量的离液盐以去除蛋白质和有色污染物。这之后总是进行乙醇洗涤以除去盐。

　　如果准备开始时没有大量蛋白质，例如质粒准备或 PCR 清理，则只需要乙醇清洗。

　　去除离液盐对于获得高产量和高纯度 DNA 或 RNA 至关重要。有些试剂盒甚至会用乙醇清洗色谱柱两次。

　　如果盐留在后面，核酸的洗脱会很差，A230 读数会很高，导致 260/230 比率较低。

　　对于无乙醇 DNA 和 RNA，您需要干转

　　乙醇洗涤后，大多数协议都有一个离心步骤来干燥柱子。这是为了去除乙醇，对于干净的洗脱液是必不可少的。

　　当将 10 mM Tris 缓冲液或水施加到膜上进行洗脱时，核酸会水合并从膜上释放出来。如果柱子上仍有乙醇，则核酸不能完全再水合。

　　跳过干燥步骤会导致乙醇污染和低产量。我没有在 Nanodrop 上看到乙醇吸光度，因此它不会出现在您的读数中。

　　问题的主要指标是当您尝试将样品加载到琼脂糖凝胶上时，DNA 不会下沉。即使在负载染料存在的情况下。另一个指标是，如果您将样品放在 -20°C 中，它不会冻结。

　　RNA 和 DNA 提取，最后的前沿：洗脱

　　DNA 提取方案的最后一步是从硅胶中释放纯 DNA 或 RNA。

　　对于 DNA 制备，通常使用 pH 值在 8-9 之间的 10 mM Tris。DNA 在弱碱性 pH 值下更稳定，在缓冲液中溶解得更快。即使对于 DNA 颗粒也是如此。水的 pH 值往往较低，低至 4-5，高分子量 DNA 可能不会在用于洗脱的短时间内完全再水化。

　　通过在离心前让缓冲液在膜中停留几分钟，可以最大限度地洗脱 DNA。

　　另一方面，RNA 在微酸性的 pH 值下很好，因此水是首选的稀释剂。RNA 易溶于水。

　　RNA 和 DNA 提取还会出现哪些其他问题

　　低产量

　　如果您的 DNA/RNA 产量低于您对样品的预期，则需要考虑许多因素。通常，这是一个裂解问题。不完全裂解是低产量的主要原因。它也可能是由不正确的绑定条件引起的。确保使用新鲜的优质乙醇（100% 200 证明）来稀释缓冲液或添加到结合步骤中。劣质乙醇或旧库存可能已经吸收了水，并且浓度不正确。如果洗涤缓冲液制备不当，您可能正在洗掉提取的 DNA 或 RNA。

　　低纯度

　　如果提取的 DNA 被蛋白质污染（低 260/280），那么可能您开始时样品过多，而蛋白质没有完全去除或溶解。

　　如果 DNA 的 260/230 比率较差，则问题通常是结合或洗涤缓冲液中的盐分。确保使用最高质量的乙醇制备洗涤缓冲液，如果问题仍然存在，请再次洗涤色谱柱。

　　与其他样品相比，一些样品含有更多的抑制剂。环境样品特别容易出现纯度问题，因为腐殖质在萃取过程中会溶解。

　　腐殖质的行为与 DNA 相似，很难从硅胶柱中去除。对于这种类型的样品， 存在专门的技术来在柱步骤之前去除蛋白质和腐殖质。

　　降解

　　这对于 RNA 制备来说更受关注，这里有一篇文章给出了关于 RNA 分离的具体建议。

　　主要是在 RNA 提取中，由于样品储存不当或裂解效率低下而发生降解，当然前提是您用不含 RNase 的水洗脱。

　　对于 DNA 提取，降解不是一个大问题，因为对于 PCR，DNA 可以被剪切并且工作正常。但是，如果您希望没有那么多剪切的 DNA，那么您可能使用了太强的裂解方法。

　　PCR 净化特殊注意事项

　　PCR 净化本身显然不是一种 DNA 提取技术，但它是一种很好且简单的技术，因为它只是添加高浓度的结合盐（通常在每体积 PCR 反应中加入 3-5 体积的盐）并通过离心列。

　　因此，当 PCR Clean-up 试剂盒失效时，尤其令人沮丧。我问人们的第一个问题是“你检查过凝胶上的 PCR 结果吗？” 因为您无法通过紫外线检查 PCR 反应并获得准确的 DNA 定量。

　　在 260 度吸收紫外线的 PCR 反应中有太多：核苷酸、去污剂、盐和引物。

　　根据我的经验，PCR 清理试剂盒经常无法正常工作是由 PCR 反应失败导致的，因此没有什么需要清理的。但如果您知道您有一个强 PCR 产物，最好的方法是在结合后保存您的流通部分。

　　如果 DNA 不结合，那就是它的位置。你总是可以拯救它，然后再次清理它。然后致电技术支持并要求更换套件。

　　自信满满地进行 RNA 和 DNA 提取

　　当然，作为科学家，我们想确切地知道我们的实验发生了什么，并且能够在不必先致电技术服务的情况下进行故障排除。

　　我希望这篇文章有助于阐明一些关于用于 RNA 和 DNA 提取的二氧化硅自旋过滤法的科学知识，以便您做出自己的诊断和修复。

　　因此，当您致电技术服务时，您将首先仔细检查一些最可能导致问题的原因，而不是经历大量繁琐的工作，您可以更快地找到解决方案。即使那是免费更换的 DNA 提取试剂盒！