我们都熟悉 DNA 和 RNA，这两种天然存在的核酸可以储存遗传信息。但是你听说过异种核酸（XNAs）吗？如果您不熟悉这些合成核酸类似物，请不要惊慌！

　　我们将带您了解 XNA 是什么，如何将它们应用于生物学研究，以及如何开始在实验中使用它们。

　　XNA 可用于许多基因工程应用。这些包括扩展遗传密码和创建适体——合成寡核苷酸或特异性结合酶等靶分子的肽。XNA 也比它们的自然对应物更稳定（继续阅读以找出原因）。

　　XNA 也被用作分子诊断的工具。通过结合合成生物学方法来检测靶核酸序列，它们在开发新型诊断分析方面变得越来越流行。

　　什么是异种核酸 (XNA)？

　　尽管 XNA 在自然界中不存在，但它们与天然存在的核苷酸相似，但存在一些显着差异。

　　核苷酸包括三个主要部分：

　　磷酸基团；

　　呋喃糖；和

　　含氮碱基。

　　所有这三个部分都可以通过合并不自然发生的不同组进行综合修改或设计。

　　图 1 显示了两种广泛使用的 XNA：d5SICS 和 dNaM，以及它们天然存在的对应物 dATP 和 dGTP。

　　图 1. XNA d5SICS 和 dNaM 及其天然对应物 dATP 和 dGTP 的 Haworth 预测。

　　因此，XNA 是非标准 DNA 和 RNA 类似物，具有改变的糖环、碱基或骨架，它们遵循 Watson-Crick 配对规则并允许非自然碱基配对。更重要的是，它们仍然能够存储和传递遗传信息。

　　如何使用 XNA？

　　由于其多样性，XNA 为合成生物学、治疗学、分子诊断学和生物技术中的新应用提供了许多可能性。我们在下面谈到了其中一些应用程序。

　　1. 使用 XNA 扩展核酸的效用

　　随着核酸化学的进步，与天然核酸相比，XNA 的碱基配对稳定性得到了改进，在活组织中的活性也得到了提高，从而扩大了它们在实验室中的用途，并导致了几种核酸治疗剂的开发。这里有几个例子来说明这是如何实现的。

　　改变磷酸二酯主链以增加稳定性

　　DNA的磷酸二酯骨架可以通过用硼或硫原子代替与磷原子单键结合的氧原子来修饰。这些分别产生硼磷酸盐 [1] 和硫代磷酸盐 [2]，由这些 XNA 组成的聚合物对核酸酶具有抗性，从而提高了它们在治疗应用中的稳定性。[3]

　　取代呋喃糖环提高熔解温度

　　另一种应用涉及用不同的糖部分取代呋喃糖环（核糖或脱氧核糖）。

　　锁定核酸(LNA) 就是一个很好的例子，其中亚甲基与 4' 碳的共价键和 2' 碳的氧（连接它们的额外桥）“锁定”了五碳糖环确认稳定 LNA-DNA 和 LNA-RNA 双链体。

　　与 DNA-DNA 和 DNA-RNA 双链体相比，这增加了熔解温度。[4]

　　将 LNA 结合到寡核苷酸引物或探针中可以缩短它们，但仍允许在更高温度下退火。如果您使用天然核苷酸，则需要更长的寡核苷酸。

　　因此，结合 LNA 的 PCR 引物可以在各种条件下提高 PCR 扩增灵敏度——LNA 已被证明可以增强实时 PCR 和 DNA 测序。[4]

　　2. 扩展基因字母表

　　也许 XNA 最直接的应用是它们在创建扩展的遗传密码方面的实用性，这在合成生物学中引起了极大的兴趣。使用六个核苷酸而不是四个核苷酸，理论上可以形成 216 个可能的密码子。这使得更多的信息能够存储在 DNA 中，从而使扩展的遗传密码有可能产生在自然界中受到限制的新型生化途径。

　　这是如何实现的？使用胸腺嘧啶或胞嘧啶类似物修饰核碱基以维持 Watson-Crick 氢键是一种策略。另一种是使用相互“配对”的疏水碱基，模拟配对天然碱基的形状。[3]

　　用 XNA 合成聚合酶

　　扩展遗传密码的第一步是让现有的酶将 XNA 整合到复制的 DNA 或合成的 mRNA 中。[5] 在称为 d5SICS的 XNA和另一个称为 dNaM的 XNA 之间，或在 d5SICS 和称为 dMMO2 的 XNA 之间形成的配对可以在体外掺入 DNA 聚合物 [6] 并使用 T7 RNA 聚合酶在体外转录。[7]

　　下一步是让活细胞将 XNA 整合到 DNA、tRNA 和 mRNA 中，并在密码子内产生非天然碱基对，进而编码非天然氨基酸 (UAA)。例如，一项研究使用工程化大肠杆菌将 dNaM 碱基对和另一种称为 dTPT3（一种 d5SICS 类似物）的 XNA 结合到复制的 DNA 中。这些 XNA 也被转录成 tRNA 和 mRNA，并使用同源氨基酰基转移酶，将 UAA 吡咯赖氨酸整合到修饰的超级文件夹 GFP 中。[8]

　　3. 基于适体的治疗

　　XNA 还具有有用的生物技术应用，因为它们可用于创建比其天然对应物更稳定的新型适体。被称为指数富集配体系统进化 (SELEX)的体外筛选方法可用于从寡核苷酸中产生新的高亲和力配体。[9]

　　这些方法已被用于治疗活性，但寡核苷酸在被引入血液时会迅速降解，这并不是一种很好的治疗方法！但是，您可以使用 XNA 进行 SELEX，包含这些的配体将更加稳定。

　　在一项研究中，发现使用含有己糖醇而不是脱氧核糖的 XNA 的适体在人血清中具有 DNase I 抗性，并与一种称为血管内皮生长因子 (VEGF) 的蛋白质结合。[10] 考虑到它在肿瘤生长和炎症性疾病中的作用，VEGF 是一个有趣的靶标，这种基于 XNA 的适体具有治疗用途的潜力。

　　4. 分子诊断的创新

　　XNA 也可用作分子诊断工具。如前所述，LNA 比其天然核苷酸对应物具有更高的杂交解链温度，从而能够制造更短的PCR 引物或PCR 探针。这允许人们通过扩增较短的 DNA 片段来获得足够的灵敏度和特异性。

　　分子诊断创新的一个很好的例子是一种检测淋巴瘤中BCL1和BCL2基因突变的检测方法。[11] 较短的扩增子（即扩增的 DNA 的延伸）是使用由天然核酸组成的引物和探针来解决先前限制的解决方案。在以前的工作中，需要更长的扩增子才能达到临床级检测所需的特异性。

　　LNA 可以使用更短的引物和探针，因此可以使用更短的扩增子。如果您的 PCR 是针对富含 GC 的 DNA 区域，这种方法特别有用。[12]

　　类似地，XNA 异鸟苷 (iG) 和异胞苷 (iC) 配对的亲和力高于天然鸟苷和胞苷。[13] 这具有稳定它们所包含的双链体的效果。Luminex 的 MultiCode®-RTx 检测技术 [14] 使用 iG 和 iC 来实现无探针实时 PCR，因为 iC 和 iG 彼此特异性杂交，而不是与其天然存在的对应物杂交。

　　如何制作合成 DNA

　　在体外和体内将 XNA 掺入 DNA 和 RNA是可以实现的，但需要对合适的细胞宿主进行工程改造。[8]

　　那么你如何开始呢？

　　如果您对体外方法感到满意，那么您很幸运。一种相对简单的方法是化学合成 DNA 或 RNA 聚合物以结合 XNA。

　　QIAGEN 会为您做这件事。他们的LNA Oligo Optimizer 工具允许您将带有 LNA 的 DNA 序列输入网络界面并确定熔解温度；您还可以查看是否会有任何二级结构或自我互补。XNA，例如 iG 和 iC，可以通过 IDT（集成 DNA 技术）整合到 PCR 引物和探针中。[15]

　　另一种方法是使用 PCR 或体外转录在体外生成 DNA 或 RNA 片段。可以使用Taq聚合酶将形成氢键的 XNAs triaza-isoG (dP) 和硝基吡啶酮 (dZ) 掺入扩增的 DNA 中。同样，疏水性核碱基 XNA dNaM 和 d5SICS 也由Taq聚合酶加工。[16]

　　dNaM 和 d5SICS 可以通过 T7 RNA 聚合酶在体外转录。[7] 要创建包含这些的 DNA 或 RNA 片段，您只需将 XNA 添加到您的常规 PCR 混合物中，然后让酶来完成工作！

　　下一步在哪里？

　　使用 XNA的体内方法相对较新，合成生物学是一个快速发展的领域。合成生物学可以使用由 XNA 组成的平行生物学来创建合成生命形式，并通过将 XNA 添加到遗传密码中来增强现有生命形式。

　　就我们可以创造具有扩展遗传字母表的新生物而言，存在概念证明，但它如何影响新陈代谢、生物化学和合成生命的亚细胞组织仍有待确定。[17,18]