A. 溶液与试剂

　　注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

　　20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O，然后将其混匀。

　　洗涤缓冲液：1 X PBS/0.05% Tween® 20，(20 X PBST #9809)。

　　封闭缓冲液：1 X PBS/0.05% Tween® 20，1% BSA。

　　1X 细胞裂解缓冲液：10 X Cell Lysis Buffer ( #9803)：为了制备 10 ml 1 X 细胞裂解缓冲液，添加 1 ml 10 X 细胞裂解缓冲液至 9 ml dH2O，混合。PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (#7018) 1 X：这种缓冲液如原样直接使用。两种缓冲液可以贮存在 4°C 以供短期使用（1–2 周）。

　　推荐：使用之前即刻添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF) ( #8553)。

　　注：关于裂解缓冲液推荐，请参考产品专用数据表或网页。

　　牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。

　　TMB 底物：(#7004)。

　　终止液：(#7002)

　　注：每天都应制备新鲜试剂。

　　B. 制备细胞裂解物

　　对于贴壁细胞

　　当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。

　　移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。

　　去除 PBS，每块平板（10 cm 直径）添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF，平板放在冰上孵育 5 分钟。

　　从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。

　　在冰上超声处理裂解物。

　　在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

　　对于悬浮细胞

　　当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时，通过低速离心（约 1,200 转/分钟）移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。

　　通过低速离心（约 1,200 转/分钟）收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。

　　从 50 ml 生长培养基收获的细胞可以在含 1 mM PMSF 的 2.0 ml 1 X 细胞裂解缓冲液中裂解。

　　在冰上超声处理裂解物。

　　在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

　　C. 包被程序

　　用 200 µl dH2O 淋洗微量平板，弃去液体。在纸巾上蘸干以确保各孔干燥。

　　在 1 X PBS 中 1:100 稀释捕获抗体。对于单块 96 孔板，添加 100 µl 捕获抗体母液至 9.9 ml 1 X PBS。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 4°C 孵育过夜（17–20 小时）。

　　在过夜包被后，轻柔地揭开平板的盖子，并洗涤各孔：

　　将平板内容物弃入容器中。

　　用洗涤缓冲液洗涤 4 次，每次 200 µl/孔。每次洗涤的时候都要将平板拍在未用过的纸巾上，拍击力度要足够大，这样才能清除每个孔中的残余溶液，但无论何时都不应让孔处于完全干燥的状态。

　　用无绒织物清洁全部孔的底面。

　　封闭平板。添加 150 µl 封闭缓冲液/孔，盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。

　　在封闭后，洗涤平板（C 部分，步骤 3）。平板可直接使用。

　　D. 检测程序

　　裂解物可以不稀释使用或在封闭缓冲液中稀释使用。每孔添加 100 µl 裂解物。盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。

　　洗涤平板（C 部分，步骤 3）。

　　在封闭缓冲液中 1:100 稀释检测抗体。对于单块 96 孔板，添加100 µl 检测抗体母液至 9.9 ml 封闭缓冲液中。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 1 小时。

　　洗涤平板（C 部分，步骤 3）。

　　将二抗，即链霉亲和素抗小鼠或抗兔-HRP，在封闭缓冲液中 1: 1000 稀释。对于单块 96 孔板，添加 10 µl 二抗母液至 9.99 ml封闭缓冲液。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 30 分钟。

　　洗涤平板（C 部分，步骤 3）。

　　向每个孔中添加 100 µl TMB Substrate。盖住平板并在 37°C 孵育 10 分钟。

　　向每个孔中添加 100 µl STOP Solution。温和振摇数秒。

　　在微量平板读数仪上在 450 nm 吸光度读取平板。

　　目视测定：在添加 STOP Solution 后 30 分钟内读取。

　　分光光度测定：用无绒织物擦拭孔的底面。在添加 STOP Solution 后 30 分钟内在 450 nm 读取吸光度。