对于荧光性蛋白质印迹法，我们强烈推荐使用 TrueBlack® Fluorescent Western Blot Blocking Buffer Kit #40683。该试剂盒经专门配制，以通过阻断荧光团标记抗体与蛋白质印迹膜之间的非特异性相互作用，提高荧光性蛋白质印迹分析的特异性和灵敏度。与标准抗体稀释剂和封闭液相比，使用 TrueBlack® Fluorescent Western Blot Blocking Buffer Kit 时产生更少的背景和更亮的目标信号。如果使用这款试剂盒，请使用产品网页或数据表上的试剂盒专用实验步骤。

　　使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060（上图）、Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691（中图）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图），对未经处理 (-) 或经 LY294002 #9901 或 Calyculin A #9902 (+) 处理的 Jurkat 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。用我们的标准抗体稀释剂和封闭缓冲液（左图）或用 TrueBlack® Fluorescent Western Blot Blocking Buffer Kit（右图）处理蛋白印迹膜。使用 TrueBlack® Fluorescent Western Blot Blocking Buffer Kit 时，可观察到抗体灵敏度增加，背景荧光减少。

　　注：双色蛋白质印迹法需要不同物种的一抗和标记有不同染料的二抗。表位重叠可能造成干扰，因而应当在双色蛋白质印迹法中加以考虑。如果一抗需要不同的一抗孵育缓冲液，则在两种缓冲液中分别对每种一抗进行检验，以确定最适合进行双重标记实验的缓冲液。

　　对于蛋白质印迹法，将膜与使用 5% w/v BSA 或脱脂奶粉的 1X TBS、0.1% Tween® 20稀释的一抗在 4°C 下孵育过夜，同时轻轻振摇。请参阅一抗产品网页，了解推荐的一抗稀释缓冲液和抗体稀释度。

　　A. 溶液与试剂

　　注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

　　20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O，然后将其混匀。

　　10X Tris 盐缓冲液 (TBS)：( #12498) 要制备 1 L 1X TBS：向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X TBS，然后混匀。

　　1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) ；通过添加 1/10 体积的 30 X DTT 至 1 体积的 3 X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3 X 还原上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。

　　10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：( #4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：向 900 ml dH2O 中添加100 ml 10X 电泳缓冲液，然后混匀。

　　10X Tris-Glycine 转移缓冲液：( #12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：向 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中添加 100 ml 10X 转移缓冲液，然后混匀。

　　含 Tween® 20 的 10X Tris 盐缓冲液 (TBST-10X)：( #9997) 要制备 1 L 1X TBST：向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X TBST，然后混匀。

　　脱脂奶粉：(#9999)。

　　封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBS；要制备 150 ml，向 150 ml 1X TBS 中添加 7.5 g 脱脂奶粉并充分混匀。Tween ® 20不应添加至封闭缓冲液中，因为它具有自发荧光并且能够增加非特异性背景。在封闭步骤之后，随后的稀释剂缓冲液中再添加 Tween® 20。

　　洗涤缓冲液：1X TBST。

　　牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。

　　一抗稀释缓冲液：如一抗数据表上所示，含 5% BSA 或 5% 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 20 ml，向 20 ml 1X TBST 中添加 1.0 g BSA 或脱脂奶粉并充分混匀。

　　二抗稀释缓冲液：含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 20 ml，向 20 ml 1X TBST 中添加 1.0 g 脱脂奶粉并充分混匀。（二抗；抗兔 #5151 和 #5366；抗小鼠 #5257 和 #5470）。

　　预染蛋白质标准品，宽范围 (11-190 kDa)：(#13953)。

　　印迹膜和纸：(#12369) 本实验步骤已针对硝酸纤维素膜进行了优化（推荐）。通常推荐 0.2 µm 孔径。

　　B. 蛋白质印迹

　　制备样品的常规流程。

　　添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。

　　从培养物中吸出培养基；使用冷的 1X PBS 洗涤细胞；吸取。

　　加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板每平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。

　　超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。

　　取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。

　　微量离心机内离心 5 分钟。

　　上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

　　注：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样以验证电转移和确定分子量。预染标准品在近红外波长范围内具有自发荧光。

　　电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

　　C. 膜封闭和抗体孵育

　　注：容量适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，请相应调整容量。

　　（可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。

　　将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。

　　关键步骤：切勿在封闭缓冲液中加入 Tween® 20（A 部分，步骤 8）。

　　用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

　　将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。

　　用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

　　将膜与荧光素偶联的二抗（#5470、#5257、#5366、#5151）（稀释度为 1:5000-1:25,000 的 1 mg/ml 原液）在室温下于 10 ml 二抗稀释缓冲液中孵育 1 小时，并不时轻轻晃动。

　　用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

　　D. 蛋白质检测

　　将膜上多余的 TBST 沥干，可使其干燥。

　　关键步骤：对于荧光染色，必须确保膜干燥。

　　请使用合适的荧光扫描仪并根据制造商的建议扫描膜。