本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法，进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。

　　A. 溶液与试剂

　　注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

　　20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 的 1X PBS，将50 ml 20X PBS 加入到 950 ml dH2O 中，并混匀。

　　10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 10X 细胞裂解缓冲液加入到 9 ml dH2O 中，并混匀。

　　注：使用前，立刻加入 1 mM PMSF (#8553)。

　　3X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) ；通过添加 1/10 体积的 30 X DTT 至 1 体积的 3 X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3 X 还原上样缓冲液。

　　Protein A 或 G 琼脂糖珠（针对非偶联的一抗）：使用蛋白 A (#9863) 和蛋白 G (#37478) 分别进行兔 IgG 免疫沉淀和小鼠 IgG 免疫沉淀。

　　固定的链霉亲和素（偶联珠子）（针对生物素化抗体）：(#3419) 轻柔涡旋振荡小瓶，并在每次免疫沉淀法中使用 10 µl。

　　10X 激酶缓冲液（激酶测定）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液加入到 900 µl dH2O 中，并混匀。

　　ATP (10 mM) （激酶测定）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将 10 µl ATP (10 mM) 加入到 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

　　B. 制备细胞裂解物

　　吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。

　　在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。

　　去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。

　　从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。

　　在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。

　　在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

　　C. 免疫沉淀法

　　细胞裂解物预清除（对于非接合和生物素化抗体为可选步骤。）

　　重要事项：强烈建议使用相应的同型对照，以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗，把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗，把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗，把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗，把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗，Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配，并与一抗样品同时进行。

　　向浓度为 1 mg/ml 的 200 μl 细胞裂解物中添加 20 μl 蛋白 A (#9863) 或蛋白 G (#37478) 琼脂糖 50% 珠浆、10 μl Streptavidin (Sepharose® Bead Conjugate #3419) 进行生物素化抗体检测。

　　在 4°C 下，旋转孵育 30-60 分钟。

　　4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。

　　根据所使用的一抗，继续下述其中一项的具体步骤。

　　使用非偶联的一抗

　　将一抗（按产品数据表中建议的合适稀释比例）添加到 200 µl 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。

　　添加蛋白 A (#9863) 或蛋白 G (#37478) 琼脂糖（20 µl 50% 珠浆）。轻轻摇动，并在 4°C 下孵育 1-3 小时。

　　4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。

　　继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

　　使用生物素化一抗

　　将生物素化抗体（按产品数据表中建议的合适稀释比例）添加到 200 µl 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。

　　轻柔混匀固定化的 Streptavidin (Sepharose® Bead Conjugate #3419)，并加入 10 µl 珠浆。轻柔震荡下，在 4°C 孵育 2 小时。

　　4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。

　　继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

　　使用固定化的抗体 (Sepharose® Bead Conjugate)

　　轻轻混合，并添加固定的微珠接合物 (10 µl) 到浓度为 1 mg/ml 的 200 µl 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。

　　4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。

　　继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

　　使用固定化的抗体 (磁珠偶联)

　　轻轻混合，并加入偶联固定化的珠子 (10 µl) 到浓度为 1 mg/ml 的 200 µl 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。

　　将试管放在磁性分离架（#7017 或 #14654）上使磁珠沉淀，并等待 1 - 2 分钟，直至溶液变得澄清。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。

　　继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

　　D. 样品分析

　　继续下述其中一项的具体步骤。

　　注：勿离心磁珠。应使用磁性分离架（#7017 或 #14654）。

　　用蛋白免疫印迹法进行分析

　　在 20-40 µl 3X SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。

　　将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。

　　将样品 (15-30 µl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。

　　用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

　　注：对于分子量接近 50 kDa 的蛋白，我们建议使用 Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) 作为二抗，以将变性重链产生的遮盖作用减到最小。对于分子量接近 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) 或 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) (#5127)。

　　用激酶活性测定法进行分析

　　用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。

　　在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。

　　30°C 条件下孵育 30 分钟。

　　用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。

　　将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。

　　将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。

　　将样品 (15-30 µl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。