体外：

　　细胞划痕实验

　　Transwell

　　体内：

　　裸鼠尾静脉注射

　　1

　　细胞划痕实验

　　细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以检测贴壁生长肿瘤细胞的迁移能力。

　　实验优点：

　　1）在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。

　　2）适合研究细胞与胞外基质（ECM）、细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。

　　3）与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。

　　4）研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。

　　实验材料：

　　1）细胞样品

　　2）仪器、耗材：6孔板 Marker笔 直尺 枪头

　　3）试剂、试剂盒：无血清培养基、PBS

　　实验步骤：

　　1）所有能灭菌的器械都要灭菌；

　　2）超净工作台紫外线消毒30min；

　　3）6孔板背面画线5-6条；

　　4）每孔加入5x10 5个细胞并培养约24h；

　　5）用1ml枪头垂直于孔板和线制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致；

　　6）吸掉旧培养基，用无菌PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞后，再加入无血清培养基，根据需要设加实验组、对照组；

　　7）放入37℃ 5%二氧化碳培养箱，培养。按0、6、12、24小时取样拍照。

　　2

　　Transwell

　　Transwell：

　　Transwell是一种应用Transwell小室来探究细胞共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等问题的实验技术。

　　材料准备及说明：

　　1）Transwell小室：常用8.0μm膜，铺胶130rmb、不铺胶40rmb，可重复利用；

　　2）上层培养液：无血清培养基，为维持渗透压，需要加入0.05%~0.2% BSA；

　　3）细胞：有侵袭能力的细胞

　　先撤血清让细胞饥饿12~24h，再进行实验；

　　4）基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel；

　　5）下层培养液：含5%~10% FBS的培养基。也可用趋化因子；

　　6）细胞培养板：6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。

　　实验步骤：

　　1.Transwell小室制备：

　　1）包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干；

　　2）水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。

　　2.取细胞悬液加入Transwell小室，24孔板小室一般200μl。细胞密度为1~10x10 5个。

　　3.24孔板下室一般加入500μl含FBS或趋化因子的培养基。

　　4.培养细胞：常规培养48h

　　5.结果测定：

　　1）直接测定：细胞染色，镜下计数；

　　2）间接测定：MTT法、荧光试剂检测、结晶紫染色。

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　　裸鼠尾静脉注射

　　小鼠转移模型分类：

　　1.人工转移模型：将肿瘤细胞体外培养或腹水进行注射，在肺（尾静脉注射）、脑（颈动脉注射）、肝脏（肝动脉注射）等部位观察。

　　2.自发转移模型：肿瘤细胞接种在小鼠腋部或足趾的皮下、腹腔肌肉或原组织中，观察转移灶。

　　实验步骤：

　　1.裸鼠选择：4~6周裸鼠；

　　2.细胞的选择：查阅文献选择合适细胞株；

　　细胞浓度：动物肿瘤一般接种2~600万/只就100%成瘤，而人癌则需要1000万以上才能较高的成瘤；

　　3.注射技巧：

　　1）固定：50ml离心管自制或购买成品；

　　2）注射位置：鼠尾部侧面的两条静脉，一般在尾部远端的1/3到1/2处进针。

　　3）注射：选择1~2ml注射器，针头采用4号或4.5号；

　　4）凸显静脉：温水、烤灯等。

　　4.观察结果：

　　1）影像

　　2）大体解剖测量：

　　3）组织切片染色