做肿瘤研究的人，很少有不知道 transwell 实验的，它是用来研究肿瘤细胞的迁移侵袭转移情况的一种简便快捷的实验方法，还可以构建两种细胞的共培养体系以及趋化性试验。今天咱们就来讲讲怎么做肿瘤细胞的侵袭转移实验。

　　实验原理01

　　什么是Transwell侵袭实验

　　Transwell侵袭实验是用一层聚碳酸酯膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞接种到低营养的培养液里，通常膜孔都被Matrigel覆盖，模仿细胞外基质，肿瘤细胞必须分泌水解酶并通过变形运动才能穿过铺有Matrigel的滤膜，计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭能力，其原理图如图1所示。

Transwell原理示意图

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　　实验准备

　　a）Transwell小室

　　b）基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，需要提前12h将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜。因其4℃时是液体，在 37℃会逐渐凝固成胶状，且不可逆。它能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了；

　　c）上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，可以加入0.05%-0.2%BSA；

　　d）下层培养液：下层培养液采用含5%－10%FBS的培养基，具体浓度根据细胞转移力而定，转移力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子“引诱”细胞转移，如将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子；

　　e）细胞培养板：常用6孔板、12孔板、24孔板等。其中，以24孔板最常用，下面就以24孔板为例。

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　　实验步骤

　　1.基质胶铺板

　　用 Matrigel 1：8 稀释（可以直接用无血清的培养基稀释），包被 Transwell 小室底部膜的上室面，置 37℃孵箱 1-4h 使 Matrigel 聚合成凝胶

　　2.接种细胞

　　用无血清培养液配成单个细胞悬液，以每孔合适的细胞数量接种到transwell小室内。

　　3.固定封片及染色

　　取出transwell小室，弃去孔中培养液，PBS洗涤2遍，甲醇固定30min，将小室适当风干；0.1%结晶紫染色15分钟，PBS冲洗干净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞；

　　4.结果统计

　　400倍显微镜下随机选取5个视野统计结果。

　　说到结果统计分析，一般来说，对Transwell侵袭实验结果统计分析有两种方法

　　01

　　直接计数法：

　　通过给细胞染色，直接在镜下计数。选择不同的视野拍照（一般选择呈现视野中穿过的细胞），计数的结果可做成统计图，辅助呈现数据

　　02

　　间接计数法：

　　间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。它包括：MTT法、 荧光试剂检测、 结晶紫检测。

　　那这两种方法，我们应该怎样选择？

　　实际上，我们一般选择直接计数法，但是在遇到细胞数量过多，难以计数时，我们可以选择第二种方法。

　　#注意事项

　　01细胞接种剂量

　　不同的细胞，其侵袭能力是不同的，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，最后会难以统计结果；而细胞量过少，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，进入下室。因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

　　02避免产生气泡

　　下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，将小室放入培养板时要注意，如有气泡产生，须将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

　　03检测时间点

　　培养时间主要依癌细胞侵袭能力而定，时间点的选择除了要考虑到细胞、细胞侵袭力及处理因素等。

　　04注意事项

　　注意铺胶厚度，太薄不能盖过底，太厚将加长其接触底面时间，在实验预定时间内不能收到预期结果。

　　05小贴士

　　对于比较难穿膜的细胞，可以在实验开展前撤掉血清节饥饿处理12h-24h。