细胞铺板是细胞实验中最常见又必须掌握的一门技术，看起来是非常简单的一项操作，但其实却经常会遇到：细胞分布不均匀的情况。要知道把用于实验的细胞铺的均匀且密度适宜，不仅看起来赏心悦目，更是决定了我们实验的稳定性。但是后来才发现，其实细胞铺板是有规律可循的，今天我们就来了解一下：细胞铺板的技巧。我们先来看两组细胞分布不均的图片。

图一：中间多

图二：周围多

　　为什么要细胞铺板

　　需要根据实验目的选择不同规格的培养板。如在进行药物对待测细胞半抑制率（IC50）测试时，通常使用96孔板，一方面可以设置浓度梯度；另外还可一次性测多个药物，减少实验误差。下面我列举一些常见的几种培养皿规格，大家可根据自己需求自行选择：

　　作为一个资深吃货，我用一个通俗易懂的例子，来跟大家解释不知道大家有没有发现，其实细胞铺板和摊煎饼有一点点相似呢？

　　煎饼的制作：准备好锅、食材等，把平底锅锅洗干净，平底锅内擦一层油，盛一勺面糊倒入锅内，旋转锅面使面糊均匀流动糊满锅面，然后点火用最最小火煎半分钟，关火收工。

　　铺细胞也是一样一样的:

　　首先需要一个液化气罐（酒精灯)，一个平底锅，根据实验需求（有6孔板、12孔、24孔、96孔)，你还需要有一瓶豆油（培养基），刷锅水（PBS），勺子(移液器），各种调料（mimics、inhibitor、G418、5-FU、lipo2000等)，面糊（细胞悬液）。

　　好了，下面可以开始做煎饼了（铺细胞）:

　　1、点火;

　　2、准备好工具和调料;

　　3、刷锅水（PBS）洗两遍;

　　4、放点油（培养基)，摇匀;

　　5、倒入拌匀的面糊（细胞悬液）﹔

　　6、摇匀，这一步骤很关键，摇不匀，煎饼就不好看了，前后摇晃10次，左右10 次，逆时针一次，顺时针一次;

　　7、放点调料，好了。关火，放到保温箱里，等你饿了（转染），随时就可以享用了。

　　细胞铺板收的三种手法：

　　1、细胞板子先加入一定量(一般是总量培养基的1/5)的培养基，放入孵箱中放置10-20min；

　　2、在滴入细胞时，细胞板子与通风橱有一定的角度，沿着板壁的孔边缘滴入；

　　3、滴入后，呈“8”字方法摇晃5-8次；

　　4、置于水平台上，放置10-20分钟；

　　5、放入孵箱

　　其实细胞铺板不一定都需要单个单个的那么均匀，比如做免疫荧光时，因为这个样子可以同时检测到单个细胞的形态，另外又可以照一点低倍的用作于统计，所有的细胞都在一个环境中。特别说明一下：这里的多也只是相对于多，细胞也是单层的。

　　铺细胞时要注意手法如下：

　　1、细胞板子不需要提前用培养基润洗，直接从边上滴入混有细胞的培养基；

　　2、放置30s-1min后，前后摇晃5-8次；

　　3、放在水平台上静置2-5min；

　　4、放入孵箱。

　　一般在提取蛋白或者提取RNA的时候有时会这样铺板，因为有些细胞刮刀不好用，没有办法刮到周围的，想要铺中间多，周围少的板子，手法如下：

　　1、细胞板子不需要提前润洗，从中间滴入进去后；

　　2、把板子朝一个方向顺时针或者逆时针旋转3-5圈；

　　3、水平台上静置2-5min；

　　4、放入孵箱。

　　细胞铺板收的常见问题解答：

　　1、细胞计数前后出现较大误差？

　　考虑细胞沉降导致悬液不匀；悬液体积过大或过小；稀释倍数太高或太低等原因造成。

　　2、如何克服细胞悬液不均匀的问题？

　　尽量将细胞吹打为单个，防止抱团，且用移液枪充分吹打，使其均匀悬浮在培养基中。

　　3、一般加多少细胞悬液合适？

　　由于加入计数室的量，过少会导致计数室内出现气泡，过多则会使得计数板上的盖玻片不紧贴计数板，使得高度变高，体积变大；计数室体积为9mm3，所以一般加15ul左右。

　　4、计数时，细胞稀释倍数如何控制？

　　若是计数室细胞过稀或过密，会造成较大误差，一般最适浓度为5～10×105细胞/ml。如一般10cm皿的细胞约300-500万个，一些细胞个体小也能达到1000-2000万，可根据所需细胞数目取出部分作稀释或连续稀释后计数。举例来说可将100ul细胞悬液加入到900ul培养基中，混匀后进行计数，计数所得乘以10即为实际细胞密度。

　　5、计数的原则有哪些？

　　计数时对压在最外圈边线的细胞遵循“计上不计下，计左不计右”的统计学原则，遇到两个以上的细胞组成的细胞团计为一个细胞

　　6、对于某些容易聚团的细胞，该怎么办？

　　对于容易聚团的细胞，尽管当时摇匀了，但是静置30min后，取出后将细胞培养板后，肉眼即可见严重的细胞居中抱团现象，比如乳腺癌细胞MDA-MB-231。对于这种细胞解决办法：从个人经验来看，若是时间允许的话，可以降低接种密度，可以隔一天细胞多了再进行药物处理或者划线等。

　　7、 如何避免每个孔之间的细胞不均匀？

　　铺板速度尽量快点，在加完半边板后，需要再次将培养皿内剩余的细胞悬液充分混匀再继续铺板。

　　细胞铺板是一个经验积累的过程，手法也需要积极的改进，不要生搬硬套，也不要一味追求绝对的铺均匀。我们在实验过程中多思考细胞本身的特征和属性，在做实验的过程中，不断尝试、不断失败、不断积累，从中得出自己的结论，希望大家可以把在实验过程中出现的问题都能积极解决。