一、实验原理

　　细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的重要技术方法。

　　当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。其中细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。

　　贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

　　克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

　　二、克隆形成的目的

　　1)通过对细胞处理后在细胞培养板上的克隆形成能力来提示处理后细胞的增殖能力。

　　2)评价不同杀伤因素(药物、基因等)对肿瘤细胞增殖能力或群体依赖性的敏感性;

　　3)评价细胞在体内成瘤性，癌细胞不一定都可以在体内成瘤，但若体外克隆能力越强，即表明体内成瘤性越强，算是一种模拟体内成瘤的体外实验。

　　三、克隆形成的分类

　　克隆形成依据采用的培养介质的不同，分为平板克隆和软琼脂克隆两类。

　　1. 平板克隆形成(Colony formation)：细胞培养在培养基中，应用于贴壁的细胞。

　　2. 软琼脂克隆形成(soft agar colony formation)：细胞被琼脂糖挂起来，主要应用于悬浮的肿瘤细胞和转化细胞系。

　　下面我们就具体看一下这两种实验技术的具体操作。

　　01平板克隆实验过程

　　所需材料

　　基础培养基(根据细胞选择适用种类)、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS、青霉素-链霉素溶液(100X)、多聚甲醛固定、结晶紫染液、 Giemsa染液

　　实验步骤

　　(1) 6孔板

　　1.将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基(基础培养基+10%胎牛血清)重悬成细胞悬液，并计数;

　　2.细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1,000个细胞/孔(根据细胞生长情况确定，一般为700个细胞/孔);

　　3.继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态;

　　4.克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗涤1次;

　　5.每孔加入结晶紫染液1ml，染细胞10-20 min;

　　6.PBS 洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照(分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照)。

　　注意事项：

　　每隔3天进行换液，在换液时，缓慢加入培养基，避免吹起细胞。

　　2.染色完成后，务必将染液清洗干净，不要在孔中有残留。

　　(2)平皿

　　1.取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在完全培养基(基础培养基+10%胎牛血清)中备用。

　　2.将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组5个平行样。每组细胞每皿分别接种100个细胞于含10ml 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。

　　3.置37℃、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

　　4.当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。

　　5.加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分钟。

　　6.去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟

　　7.用流水缓慢洗去染色液，空气干燥

　　8.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

　　克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%

　　DU145细胞克隆形成的图片(相机左，显微镜右)    

　　注意事项：

　　平板克隆形成实验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。

　　实验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

　　数据分析

　　显微镜下观察阳性克隆，即每个克隆>50个细胞，相机拍照，数克隆数(大小约在0.3-1.0 mm)计算克隆形成率，并统计克隆大小。

　　例：如研究某个基因对细胞增殖的影响，敲低前列腺癌细胞株PC3的TCTN1基因，显微镜下拍照(Scale bar=250 μm)和相机拍照，克隆的大小和数量均受到抑制。

　　软琼脂克隆形成

　　软琼脂克隆形成又名非锚定依赖性生长实验Anchorage-independent assay，利用软琼脂为培养介质，使细胞在悬浮状态下生长。

　　某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖，进而通过软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。

　　具体过程如下图所示：

　　1.配制1.2% 和0.7%琼脂，高压灭菌后，维持在42℃中使其不会凝固;

　　2.将1.2% 琼脂与2×培养基混合，铺入6孔板作为下层胶，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固;

　　3.将制备好的单细胞悬液与0.7%琼脂充分混匀，加入6孔板作为上层胶，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培养基，每3天更换一次;

　　4.根据细胞的生长速度培养2~3周后显微镜下观察克隆大小，与平板克隆一样，每个克隆>50个细胞，显微镜拍照。若拍整个孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色，37°C过夜，拍照。

　　5. 数据分析：显微镜或相机拍照，计算克隆形成率

　　例：通过软琼脂克隆形成实验检测ME2蛋白对神经胶质瘤细胞生长的影响。在神经胶质瘤细胞GBM8401中将ME2蛋白敲低，形成的克隆数减少。

注意事项

　　1.上层软琼脂使细胞分散成单个，下层软琼脂作为支撑防止细胞贴附生长。最后铺上一层培养基是为了防止胶干燥，并给细胞补充营养，如果做药物处理，则在培养基中加入药物。

　　2.上层胶细胞数目根据不同的细胞类型而定。一般以5000个细胞/孔作为起始浓度，根据需要调整。

　　3.琼脂放入水浴锅中维持在42℃左右。温度过低琼脂凝固，在做基底时琼脂凝固过快会导致不均一，温度过高则会将细胞烫死。此外，实验过程中速度要快，防止局部结块。

　　结语：如何选择细胞克隆方式

　　根据实验对象和目的选择，平板克隆检测贴壁肿瘤细胞的增殖能力和致瘤性，软琼脂克隆形成实验除了检测贴壁细胞，还能检测悬浮肿瘤细胞和转化细胞系，具有平板克隆不可取代的优势。若只是简单评价贴壁细胞的增殖能力和群体依赖性，则选择平板克隆即可。