PAP法

　　免疫组织化学是根据抗原-抗体特异性结合的基本原理，利用已知特异性抗体（或抗原）显示组织中相应化学成分——抗原（或抗体）分布的方法，具有较高的灵敏性及特异的免疫反应性。免疫组织化学包括免疫荧光法、酶标记抗体法、免疫铁蛋白法及非标记抗体过氧化物酶-抗过氧化物酶法（简称PAP法）等。PAP法是Sternberger等（1970）在免疫球蛋白-酶桥法基础上发展起来的，至今仍是免疫组织化学中最常用的方法之一。

　　一、PAP法基本原理

　　PAP法免疫组织化学反应是分四步来完成的：

　　①第一级抗体为组织中某种抗原相应的抗血清，能与组织中被检测的抗原发生特异性的结合，常用者为兔抗血清，如兔抗SP、兔抗ENK等；

　　②第二级抗体是针对第一级的，如以兔IgG免疫羊，产生羊抗兔血清。该抗体的两个Fab段，其中一个与第一级抗体的Fc段结合，另一个Fab段游离；

　　③PAP复合物（即过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物）是由两个抗体分子与三个HRP分子根据合适比例形成的稳定的五角形结构，其分子中抗HRP的Fc段与第二级抗体中游离的Fab段结合，故第二级抗体实际上是一个联系抗体，也称桥抗，这样，第一级抗体与PAP的抗HRP抗体必须来自同一种动物；

　　④成色反应：PAP复合物中的HRP催化底物中的过氧化氢水解放出氧，氧化无色的二氨基联苯胺形成不溶性的嗜锇聚合物而沉淀在被检的抗原部位，在光镜下呈深棕色颗粒。

　　二、主要仪器

　　1．恒冷箱切片机

　　2．37℃恒温箱

　　3．4℃冰箱

　　4．低温冰箱

　　5．光学显微镜

　　三、主要试剂及其配制

　　1．第一级抗体（兔抗SP、兔抗ENK等）：低温保存，使用时根据抗体的效价稀释成实际工作浓度。

　　2．第二级抗体（羊抗兔IgG）：低温保存，使用时根据抗体的效价稀释成实际工作浓度。

　　3．PAP复合物：低温保存，使用时根据抗体的效价稀释成实际工作浓度。

　　4．Millonig’s多聚甲醛固定液（pH 7.4）

　　A液：多聚甲醛 40 g

　　双蒸水 400 ml

　　置于60℃水浴中，滴加10 N NaOH溶液（约10滴），振摇至全部溶解，冷却。

　　B液：NaH2PO4·2H2O 16.88 g

　　双蒸水 300 ml

　　C液：NaOH 3.86 g

　　双蒸水 200 ml

　　将B液加入C液混合后，加入A液，调pH至7.4，加水至总量1000 ml，4℃贮存备用，此液尽可能新鲜配制。

　　5．0.01M PBS (pH7.4)

　　① 0.2M PB储备液

　　A液：Na2HPO4·12H2O 57.304 g

　　双蒸水 800 ml

　　B液：NaH2PO4·2H2O 6.24 g

　　双蒸水 200 ml

　　A+B混合，调pH至7.4，即为0.2M PB，备用。

　　② 0.01M PBS

　　0.2M PB 100 ml

　　NaCl 17 g

　　双蒸水加至 2000 ml

　　6．0.25% Triton X-100液

　　Triton X-100（加温熔化） 0.75 ml

　　0.01M PBS(pH7.4)加至 300 ml

　　7．20%蔗糖缓冲液

　　蔗糖 20 g

　　0.1M PB加至 100 ml

　　8．显色液（0.05%DAB,0.01%H2O2,0.05M Tris-HCl缓冲液，pH 7.6）

　　① 0.5M Tris-HCl储备液

　　Tris 6.057 g

　　双蒸水 50 ml

　　以1N NaOH调pH至7.6，再加双蒸水至总量100 ml,棕色瓶装，4℃保存，用时稀释10倍。

　　② 显色液

　　DAB 5 mg

　　0.05M Tris-HCl缓冲液 10 ml

　　30% H2O2 3.4μl

　　混匀，立即使用。

　　四、操作步骤

　　1．动物经腹腔注射10%水合氯醛（0.6 ml/200 g）麻醉。

　　2．开胸，剪开左心室，将平口针头插至升主动脉，结扎紧，剪开右心耳。

　　3．先用温的生理盐水200 ml灌注，冲洗血液至液体清亮。

　　4．灌注4%Millonig’s多聚甲醛液400 ml。

　　5．取脑、脊髓或所需标本，削块，置于相同固定液中4℃固定1～2天。

　　6．将组织移至20%蔗糖磷酸缓冲液，待组织下沉后即可切片。

　　7．用0.01M PBS冲洗后入恒冷箱内冰冻，切片厚度15～20μm。切片收集于0.01M PBS中，漂洗5 min×2次。

　　8．切片入0.25% Triton X-100溶液中，37℃，30 min。PBS漂洗5 min×2次。

　　9．切片入3%正常牛血清蛋白中，37℃，30 min。

　　10．切片入第一级抗体，37℃，2 h，移至4℃冰箱，保湿，48～60 h ，PBS漂洗10 min×3次。

　　11．切片移至羊抗兔IgG溶液，37℃，45 min。PBS漂洗10 min×3次。

　　12．切片入PAP复合物溶液，37℃，45 min。PBS漂洗10 min×3次。

　　13．切片入显色液内室温显色2～3 min后，立即漂洗10 min×3次。

　　14．贴于洁净载玻片上，室温凉干，逐级酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片。

　　15．显微镜观察。

　　五、注意事项

　　1．动物在灌流过程中，必须快速冲洗血液，防止血液凝固而影响固定。

　　2．各级抗体均须在低温冰箱保存，为避免反复冻融所造成的抗体效价的降低，应将抗体稀释成适当浓度，小量分装。

　　3．切片漂洗必须彻底、干净。

　　4．显色液必须新鲜配制，配后立即使用。显色时间不能超过5 min，否则产生较深的背景，不利于观察，甚至出现假阳性。

　　5．由于在外周组织中含有大量的内源性过氧化物酶，故在用外周组织进行研究时需常规使用甲醇-双氧水溶液处理，37℃，45 min，其配制如下：

　　双蒸水 4.5 ml

　　30%H2O2 0.5 ml

　　甲醇 20 ml

　　6．DAB为强烈的致癌物质，使用时必须小心操作，避免接触皮肤。

　　7．对照实验：为确定免疫反应特异性，必须进行对照实验。

　　①抗体吸收试验：将足量的抗原如SP加入抗SP血清孵育、离心、取上清液作为第一抗体，结果应为阴性。

　　②替换试验：用正常血清代替一抗，结果应为阴性。