实验原理

　　本次DNA提取操作是以染色体的形式存在于细胞核内，制备DNA将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，同时保持DNA分子的完整。提取DNA的过程是指将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。

　　在提取DNA的反应体系中，SDS用于细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使起与DNA分子分离开来。

　　实验材料

　　（1）细胞裂解缓冲液：

　　Tris (pH8.0) 100 mmol/L ；EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L； NaCL 20 mmol/L； SDS 10% ；胰RNA酶 20ug/ml。

　　（2）蛋白酶K： 称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，用一次性过滤器过滤除菌，-20℃备用。

　　（3）TE缓冲液（pH 8.0），高压灭菌后室温贮存。

　　（4）酚：氯仿：异戊醇=25:24:1（体积比）。

　　（5）NaAc 3 mol／L。

　　（6）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

　　实验过程

　　1、取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。放入匀浆器中，加入2ml细胞裂解缓冲液，然后充分研磨，至不见明显组织块，然后转入1.5ml 离心管中，以12000 rpm离心5min。

　　2、弃掉上清，加入0.4ml细胞裂解缓冲液，迅速吹散沉淀。加入20ul蛋白酶K（0.2mg/ml），混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，或转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

　　3、加入等体积酚：氯仿：异戊醇抽提一次，温柔混匀。4℃条件下，10000rpm，离心10min。

　　4、轻轻吸取上层液面，注意不要吸到两层之间的白色沉淀。如上层液面中白色沉淀较多或浑浊可以再次加入等体积酚：氯仿：异戊醇抽提一次。

　　5、向吸取的上清液中加入1/10体积的NaAc，轻柔混匀，然后加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，轻柔混匀后，-20℃冰箱中沉淀过夜。

　　6、12 000rpm 离心 20min，弃上清；加入-20℃预冷的75％乙醇，12000rpm 离心 15min 室握温干燥，加入适量无菌水溶解基因组DNA，存放于 4℃，如溶解不充分可轻摇溶解过夜。

　　注意事项

　　1、选取的组织须是新鲜材料，且处理时间不宜过长。

　　2、操作过程尽可能在低温条件进行，避免基因组DNA降解或断裂。

　　3、使用酚：氯仿：异戊醇，乙醇抽提或沉淀DNA时须轻柔操作，避免DNA降解或断裂。

　　4、实验中会使用到有机试剂，须注意防护，并在通风条件下进行操作。

　　常见问题及分析