细菌涂片及细菌染色是微生物学的基本技术，也是观察细菌最简单且行之有效的方法，是微生物检测人员常用技能之一。通常情况下，由于细菌个体较小，较透明或半透明，如未经染色往往不以观察识别。因此借助于染色法可以使细菌着色，与视野背景形成鲜明对比，从而易于在显微镜下进行观察。

　　微生物检测常见的细菌染色方法包括简单染色、负染色、革兰氏染色、芽孢染色法、鞭毛染色、荚膜染色、死活染色。制备细菌染色片一般要经过涂片、固定、染色、水洗、干燥等步骤，然后用显微镜甚至油镜观察。

　　1. 简单染色：

　　在实验室微生物检测过程中，不同细菌或者由于观察者所侧重观察的内容不同，所以使用的染料也有差异，但是简单细菌染色的方法是一样的。

　　先按照上述的制片方法制片，制成需要观察的玻片后，使用相对应的染料滴加到玻片上的菌膜区域，以覆盖菌膜为准。按照不同染料的要求，结合所观察的内容确定染色时间，染色时间到达时，进行水洗，干燥等步骤。最后得到的玻片加盖盖玻片即可进行镜检。如有需要可以后续再进行油封、蜡封等封片过程。简单细菌染色过程如下图：

　　2. 负染色

　　制备观察图片是非常容易的，但是对微生物检测初学者来说想要在玻片中找到目标菌还是有一定难度的，因为细菌常常无色透明且比较小，所以对初学者来说除非对光圈等进行很精细的调节，否则很难观察到目标菌，因此进行负染色就十分重要。该方法是将微生物与苯胺黑或者india墨水混合，再将混合物覆盖于载玻片表面，由于这两种天然黑色染料不能渗入微生物细胞，所以使得透明的微生物个体在黑色的背景下很容易观察。负染色法常见有两种操作方法。

　　第一种发个方法比较常见，在一个载玻片上将微生物与异地苯胺黑混合，用另外的载玻片将混合物均匀的覆盖于原来的载玻片上。该方法的目的是使混合物在在玻片上一边厚一边薄，在厚与薄中间的额区域就是最佳观察区域。如图所示：

　　第二种方法是用一接种环苯胺黑与微生物混合，用接种针在载玻片的中央将混合物延伸很小的区域。具体操作如图所示：

　　3. 革兰氏染色

　　革兰氏染色是微生物检测细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。细菌先经碱性染料结晶紫染色，而后经碘液进行媒染，之后用酒精脱色，在一定条件下有的细菌媒染后的颜色不会脱去，有的可以被脱去，前者叫做革兰氏阳性菌，后者为革兰氏阴性菌。为方便进一步观察，脱色后再用碱性蕃红进行复染，阳性菌仍为紫色，阴性菌染成红色，这就是革兰氏染色的原理。其步骤包括初染、媒染、脱色、复染四个步骤，主要步骤如图所示：

　　4. 芽孢染色法

　　部分细菌能产生内孢子，这些孢子能抵制细菌染色液的进入，在微生物检测革兰氏染色法涂片染色时，革兰氏阳性菌的芽孢呈现无色。虽然芽孢在革兰氏染色片中可以看到，但在不易清晰观察时，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢与菌体呈现不同颜色，便于观察。主要的芽孢染色法有孔雀绿染色法和石碳酸复红染色法。

　　孔雀绿染色法的具体步骤：首先将生有芽孢的斜面菌苔按革兰氏染色法涂片后，用饱和孔雀绿水溶液染色10min，然后用自来水冲洗，冲洗完后用0.5%蕃红液复染30s，用水洗，吸干，即可镜检，镜检时芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。

　　石碳酸蕃红染色法具体步骤：首先按常规涂片，然后滴加石碳酸复红于涂片上，并于玻片下缓缓加热，使染液冒蒸汽但不沸腾，并继续滴加染液，不使涂片上染液蒸干，这样保持5min。带涂片冷却后，倾去染液，用酸性乙醇脱色指无红色染剂洗脱为止，接着彻底水洗，洗后用吕氏美蓝复染2-3min，水洗吸干后即可进行镜检，镜检时菌体计孢囊呈蓝色，芽孢呈红色。

　　5. 鞭毛染色法

　　鞭毛是细菌的运动器官，非常纤细，超出了光学显微镜观察极限，因此通常情况下在显微镜下观察不到。通过特殊的染色技术，可以将染色液附加到鞭毛的周围，增加它的直径，从而能在光学显微镜下观察到鞭毛。鞭毛染色一般分银盐法和复红沉淀法两种。

　　这里介绍一下银盐沉淀法。用作鞭毛染色的载玻片必须是绝对干净无油脂的，将载玻片在火焰上快速灼烧5s，放在染色架上冷却，用蜡笔分成两个区域，然后用移液管或者巴斯德移液管吸取2mL无菌水加入到幼龄生长活跃的斜面菌株中，慢慢震荡并旋转试管使菌株悬浮，尽量避免使用接种环，将悬液转移到干净的试管中，通过悬滴试验检查菌体的运动型，用无菌水将悬浮液稀释至略有浑浊为止，放入20-30℃培养箱中培养30min，然后移取一满环悬浮液加在已冷却的载玻片一端，倾斜载玻片让液滴流到蜡笔画的中心线，在空气中自然干燥。然后用媒染色剂媒染5min之后，慢慢用蒸馏水充分漂洗掉所有的媒染液，用热的Fontana银盐覆盖，染色5min，每隔1min更换一次染色液（Fontana银液在沸水浴中加热），细菌涂层的每一部分都要浸在染色液中，不能裸露。最有用水冲洗，自然晾干即可进行镜检。应当注意一点，染色法的燃料须当日配制，4h内使用，最好是现配现用。

　　6. 荚膜染色

　　一般细菌的荚膜与染色剂的亲和性低，但荚膜通透性高，因此染料可以透过荚膜使菌体着色。一般采用负染色方法使背景和菌体之间形成一透明区，将菌体衬托出来便于观察分辨。

　　荚膜染色的步骤：加一滴6%葡萄糖水溶液在载玻片的一端，无菌操作，挑取细菌斜面上培养72h左右的胶质芽孢杆菌与其混合，加1滴墨汁充分混匀，用推片法制片将菌液铺成薄层，自然干燥，滴加1-2滴无水乙醇覆盖涂片，固定1min，自然干燥，在已晾干的涂面上，滴加1%结晶紫染色液染色，2min后用20%的硫酸铜冲洗数次，再用自来水冲洗一次，使用擦镜纸擦干后即可镜检。有荚膜的菌菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。具体操作过程见下图：

　　7. 死活染色

　　细菌死活染色排除法是生物研究中判断细胞活性的一种常用方法，是利用死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的，常用的染色剂有台盼蓝和美蓝，前者使用范围较广，后者一般在酵母菌细胞死活鉴定上使用较多。

　　以上介绍的细菌染色法，基本上涵盖传统微生物实验室能用到的所有的细菌染色法。染色法在细菌的观察、分类、鉴定中经常用到，因此是微生物检测人员不可或缺的基本技能之一。

　　转载自《食品微生物检测工作指南》作者贾俊涛等，转载仅为分享知识。